[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)细胞复苏及扩增

将冻存的Vero细胞复苏到T75细胞培养瓶中，并置于36-37℃温度下培养，长至单层致密后，用含0.25％胰酶的细胞分散液消化后，再加入含8-10％新生牛血清的DMEM细胞生长液传代培养，按1:(3-6)的比例逐级传代放大至3-15L转瓶内培养，转瓶按照1:(3-5)的传代比例扩传；

(2)片状载体处理

按照20-40g/L片状载体的比例，称量好所需的片状载体放入7-50L悬浮培养罐的载体框内，组装好悬浮培养罐，打入PBS缓冲液，使之充分浸泡到片状载体，10-15min后弃去PBS缓冲液，加入新的PBS缓冲液，并使其超过片状载体上界面10-15cm；

(3)悬浮培养罐及片状载体灭菌

按照悬浮培养的常规操作规程，对步骤(2)中含片状载体的7-50L悬浮培养罐进行121℃高温灭菌40-50min，冷却后取样做无菌检验；

(4)细胞上罐

将步骤(1)中3-15L转瓶内的Vero细胞消化下来，按终浓度(1-5)×10⁶cells/mL的接种密度接种到步骤(3)中的7-50L悬浮培养罐内，设定温度37℃、pH 7.0-7.2、DO 30％-60％、转速50-100rpm，开始培养；

(5)细胞悬浮培养

开始培养后22-26h，取样测定培养液的含糖量，当含糖量低于8mmoL/L时，开始灌流培养；

(6)含毒维持液配制

取调好pH 7.0-7.4并预热的DMEM溶液，加入胰酶和猪流行性腹泻病毒PEDV毒种，使最终含胰酶5-10μg/mL、猪流行性腹泻病毒PEDV毒种1％-5％，混合均匀后，置于常温待用；

(7)接毒

当悬浮培养罐Vero细胞培养到72-96h时，停止培养，将生长液弃去，通过管道加入事先预热的PBS溶液，搅拌1-5min，弃去，再加入PBS搅拌1-5min，如此洗3-5次；然后再加入步骤(6)配制的含毒维持液，设定温度37℃、pH 7.2-7.4、DO 30％-60％、转速50-100rpm，开始病毒悬浮培养；

(8)收毒

A.当病毒悬浮培养至16-24h，进行第一次收获病毒液，收获体积为培养总体积的80％-90％，放-15℃以下冷库保存；

B.在一次收毒后的余下病毒悬浮培养液中加入含5-10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养16-24h，进行第二次收获病毒液，收获体积为培养总体积的80％-90％，放-15℃以下冷库保存；

C.在二次收毒后的余下病毒悬浮培养液中再加入含5-10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养16-24h，进行第三次收获病毒液，全部收完，放-15℃以下冷库保存；

其中，每个收次的病毒液，均测定一次病毒含量。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，其特征在于，所述步骤(1)中Vero细胞为非洲绿猴肾传代细胞，购于ATCC，由华中农业大学动物医学院预防兽医学实验室保管和供应。

3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，其特征在于，所述步骤(2)中片状载体直接购买自ESCO公司。

4.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，其特征在于，所述步骤(3)中无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行。

5.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，其特征在于，所述步骤(5)中通过罗氏血糖仪测定培养液的含糖量。

6.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，其特征在于，所述步骤(5)中灌流培养的灌流速度根据培养液的含糖量进行增减调整。