[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法

说明书

本发明涉及兽用生物制品技术领域，提供了一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，包括如下步骤：细胞复苏及扩增，片状载体处理，悬浮培养罐及片状载体灭菌，细胞上罐，细胞悬浮培养，含毒维持液配制，接毒，收毒。本发明的优点在于：本发明使用片状载体悬浮培养，劳动强度小、工艺简单、培养条件佳、成本低，通过片状载体悬浮培养出的细胞量非常大，先加入含少量胰酶的维持液，使一部分先病变，再通过换液的办法，加入含新胰酶的维持液，再促使一部分病变，重复此方法使细胞逐渐病变，可实现多次收获，并且生产出抗原病毒含量是传统生产工艺的10‑30倍。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法。

背景技术

目前猪流行性腹泻病毒(PEDV)的增殖大部分采用转瓶生产工艺，然而，传统的转瓶生产工艺却存在以下几点缺点：劳动强度大，工艺复杂，细胞增殖慢且数量少，无法提供最佳的pH、DO等条件，只能一次收获，收获的病毒含量低。因此，如若要大量增殖，则只能通过增加转瓶数量的方法，结果又导致车间生产所需设备、人员等需求更大。

目前，悬浮培养技术已生成兽用生物制品的热点，通过悬浮培养技术生产出的抗原具有病毒含量高、纯净性好等特点，广泛用于兽用生物制品。

然而，已有的猪流行性腹泻病毒(PEDV)悬浮培养生产工艺，虽使病毒含量有所提高，但收毒次数较少(只能一次收获)，且生产成本较高。

据此，目前急需对现有技术改进，以提供一种劳动强度小、工艺简单、培养条件佳、细胞数高、成本低、抗原病毒含量高，且可实现多次收获的猪流行性腹泻病毒生产方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种劳动强度小、工艺简单、培养条件佳、细胞数高、成本低、抗原病毒含量高，且可实现多次收获的猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，包括如下步骤：

(1)细胞复苏及扩增

将冻存的Vero细胞复苏到T75细胞培养瓶中，并置于36-37℃温度下培养，长至单层致密后，用含0.25％胰酶的细胞分散液消化后，再加入含8-10％新生牛血清的DMEM细胞生长液传代培养，按1:(3-6)的比例逐级传代放大至3-15L转瓶内培养，转瓶按照1:(3-5)的传代比例扩传；

(2)片状载体处理

按照20-40g/L片状载体的比例，称量好所需的片状载体放入7-50L悬浮培养罐的载体框内，组装好悬浮培养罐，打入PBS缓冲液，使之充分浸泡到片状载体，10-15min后弃去PBS缓冲液，加入新的PBS缓冲液，并使其超过片状载体上界面10-15cm；

(3)悬浮培养罐及片状载体灭菌

按照悬浮培养的常规操作规程，对步骤(2)中含片状载体的7-50L悬浮培养罐进行121℃高温灭菌40-50min，冷却后取样做无菌检验；

(4)细胞上罐

将步骤(1)中3-15L转瓶内的Vero细胞消化下来，按终浓度(1-5)×10⁶cells/mL的接种密度接种到步骤(3)中的7-50L悬浮培养罐内，设定温度37℃、pH 7.0-7.2、DO 30％-60％、转速50-100rpm，开始培养；

(5)细胞悬浮培养

开始培养后22-26h，取样测定培养液的含糖量，当含糖量低于8mmoL/L时，开始灌流培养；

(6)含毒维持液配制