[发明专利]抑制茶树组培中外植体氧化褐变和内生菌污染的培养方法

摘要

本发明公开了一种抑制茶树组织培养过程中外植体氧化褐变和内生菌污染的培养方法，涉及茶树组织培养过程中内源儿茶素生物合成的抑制。该方法通过在B5基本培养基上添加2μM苯丙氨酸解氨酶抑制剂2‑氨基吲哚‑2‑膦酸(AIP)，以抑制茶树外植体中多酚化合物生物合成、显著降低表没食子儿茶素(EGC)的含量，进而抑制愈伤组织的褐变；通过在B5培养基中加入2mg/L 6‑苄基氨基嘌呤(BAP)、1mg/L噻哒隆(TDZ)、10％椰子水、和300mg/L L‑谷氨酰胺以及2μM AIP，可显著增进茶树叶片的愈伤组织诱导率及其生长速度。此外，该技术通过在B5培养基中添加150mg/L的泰门汀和30mg/L庆大霉素并用其培养茶树叶片外植体12‑24天，可以消除外植体内生菌的污染。

主权项

1.抑制茶树组培中外植体氧化褐变和内生菌污染的培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤1、获取操作对象(1)将新鲜茶树种子用自来水洗涤，除去外种皮后，浸泡一夜，使用过滤器，“漂浮种子”和“沉降种子”被分开，选用“沉降种子”为培养料；(2)将步骤1选取的种子转移到无菌的500毫升锥形烧瓶中，用水洗涤两次，在4％多菌灵浸泡过夜；次日用无菌蒸馏水冲洗多菌灵处理的种子，再用70％乙醇消毒3分钟，然后用0.1％的氯化汞消毒4分钟，再用无菌蒸馏水漂洗三次，获得无菌种子；(3)步骤2获得的种子用Whatman 1号滤纸上吸干水干燥，用无菌刀和镊子在无菌条件下除去种子外衣，然后将种子置于1/2强度的MS(Sigma)培养基上，待其发芽长成试管苗；(4)切取幼苗、并将嫩枝分段，在含有2mg/L的6–苄基嘌呤(BAP)和0.1mg/L吲哚‑3‑丁酸(IBA)的1/2强度MS培养基扩大繁殖，待用；步骤2、外植体培养将步骤1.4获得的操作对象放入Gamborg B5(B5)(Sigmaaldrich)培养基上培养12‑24天，所述培养基中还添加如下化合物：经0.2μm过滤膜灭菌的2‑3.5μM 2‑氨基吲哚‑2‑膦酸(AIP)、2mg/L 6‑苄基氨基嘌呤(BAP)、1mg/L噻哒隆(TDZ)、10％椰子水和300mg/L L‑谷氨酰胺、150mg/L的泰门汀和30mg/L庆大霉素。