[发明专利]抑制茶树组培中外植体氧化褐变和内生菌污染的培养方法

说明书

本发明公开了一种抑制茶树组织培养过程中外植体氧化褐变和内生菌污染的培养方法，涉及茶树组织培养过程中内源儿茶素生物合成的抑制。该方法通过在B5基本培养基上添加2μM苯丙氨酸解氨酶抑制剂2‑氨基吲哚‑2‑膦酸(AIP)，以抑制茶树外植体中多酚化合物生物合成、显著降低表没食子儿茶素(EGC)的含量，进而抑制愈伤组织的褐变；通过在B5培养基中加入2mg/L 6‑苄基氨基嘌呤(BAP)、1mg/L噻哒隆(TDZ)、10％椰子水、和300mg/L L‑谷氨酰胺以及2μM AIP，可显著增进茶树叶片的愈伤组织诱导率及其生长速度。此外，该技术通过在B5培养基中添加150mg/L的泰门汀和30mg/L庆大霉素并用其培养茶树叶片外植体12‑24天，可以消除外植体内生菌的污染。

技术领域

本发明涉及的是茶树组织培养和生物技术领域，其核心是在茶树培养基中，应用内源多酚合成抑制剂和可有效消除茶树内生菌的抗生素，抑制茶树组培中外植体褐变和内生菌污染的新技术。

背景技术

茶属于山茶属，起源于我国。栽培种有数个变种，如阿萨姆种，中国种等(Coasta等，2007)。与阿萨姆型品种相比，中国种的叶片较小，抗干旱和低温(Harler 1964)，含有非常高水平的多酚类物质(16～30％干重)(Almajano et al.2008；Graham 1992)。中国茶品种离体遗传改进的生物技术研究难以获得成功，不仅是因为外植体多酚氧化和褐变，而且还可能是由于田间茶树中大量存在的内生菌的污染。到目前为止，应用常规组织培养技术，难以克服茶树外植体褐变、坏死以及内生菌污染等难题，致使茶树组织培养进展缓慢，这是茶树生物技术发展的一个瓶颈。

在植物中，由于多酚氧化酶(EC 1.1418.1)(PPO)的作用，酚类化合物可以形成邻二酚，可以进一步氧化形成高度着色的邻醌类化合物(SapersHicks 1989；Janovitz-Klapp et al.1990)。邻醌类化合物与其它邻醌类化合物和蛋白质、还原糖等结合，从而形成在褐变植物组织中沉淀的聚合物(McEvily et al.1992)。使PPO表达沉默已成功地培育出非褐变的苹果(Xu 2013)。此外，苯丙氨酸解氨酶(EC 4.3.1.24)(PAL)是苯丙烷途径中的第一个酶，将L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸(HahlbrockScheel 1989)。随后的反应导致一些肉桂酸酯(咖啡酰酒石酸和二咖啡酰酒石酸)和奎尼酸衍生物(5-咖啡酰奎宁酸和3,5-二咖啡酰奎尼酸)的产生。有研究表明，这一过程导致了莴苣褐变(Tomás-Barberánet al.1997)。一些化学物质如氯化钙和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)可通过抑制PAL活性来控制植物组织褐变，从而减少酚类化合物的生物合成((Tomás-Barberán et al.1997)。一些还原剂如L-半胱氨酸或抗坏血酸可导致植物组织坏死减少(Enriquez-Obregon etal.1999；Olhoft and Somers 2001)。培养基中使用不同的吸附剂和抗氧化剂可以减轻组织褐变(坏死)，但它们对愈伤组织的诱导、农杆菌介导的转化和VIR基因的表达可能有显著的负面影响(Rana et al)，2016)。2-氨基吲哚-2-膦酸是苯丙氨酸的类似物，可抑制一些植物PAL活性和酚类化合物合成。然而，AIP对茶树外植体褐变的影响是不确定的，因为茶叶中多酚含量较高，对此开展研究很有必要。

真菌和细菌以及外植体内生菌的污染常是植物细胞或组织培养的主要障碍。细菌性植物内生菌广泛存在于髓部、厚壁组织、木质部管腔、薄壁组织中，导致植物培养损失，影响微繁殖效率。在草莓中，发现多种内生菌的存在，抗生素泰门汀、硫酸链霉素和庆大霉素的联合应用，可以有效地消除内生菌的污染(Tanprasert and Reed 1997)。王等(2016)最近在茶树品种“紫娟”和“云抗10”中发现了24种内生细菌，分别属于葡萄球菌等六种菌种。因此，很有必要开展有效根除茶树内生菌和AIP抑制多酚合成方法，以减少中国种茶树外植体组织褐变的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种抑制茶树组培中外植体褐变和内生菌污染的培养方法，以解决茶树组织培养过程中多酚氧化和内生菌污染导致的外植体褐变这一技术问题。