[发明专利]一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建

摘要

一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建，根据猪病毒性腹泻病原的基因序列，筛选出合适的TAG序列，偶联于微球；将TAG互补序列标记于各病原PCR引物的上游引物5’端，并在PCR引物的下游引物5’端标记生物素；然后利用修饰引物进行多重PCR扩增，将PCR扩增产物与偶联在微球上的TAG序列进行杂交，检测MFI值，根据MFI值判定检测结果阴性或阳性。该方法提高了检测的特异性和灵敏度，实现了对猪病毒性腹泻多重病原的定性定量检测，具有高通量、省时省力、特异性强、灵敏度高等诸多的优势，能满足同时进行多种病原检测的需求。

主权项

1.一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法，包括以下步骤：1)根据猪病毒性腹泻病原的基因序列，设计扩增猪病毒性腹泻病原的PCR引物，所述PCR引物包括上游引物和下游引物；2)根据猪病毒性腹泻病原的基因序列，选择合适的TAG序列，将TAG序列偶联于对应的微球上；将TAG互补序列标记于PCR上游引物5’端，TAG互补序列和PCR上游引物之间有12个碳原子的臂距；在PCR下游引物5’端标记生物素，获得修饰引物；3)提取样品RNA，反转录获得cDNA；4)以步骤3)的cDNA为模板，利用修饰引物进行多重PCR扩增，退火温度50～58℃，获得多重PCR扩增产物；5)步骤4)获得的扩增产物与偶联在微球上的TAG序列进行杂交，40～45℃反应20～30min，设阴性对照，检测杂交反应液，分别获得样品及阴性对照的MFI值，根据MFI值，进而确定cMFI值；当cMFI≥3时，结果判定为阳性，否则为阴性；其中，cMFI＝[MFI(样品)‑MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)。