[发明专利]一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建

说明书

一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建，根据猪病毒性腹泻病原的基因序列，筛选出合适的TAG序列，偶联于微球；将TAG互补序列标记于各病原PCR引物的上游引物5’端，并在PCR引物的下游引物5’端标记生物素；然后利用修饰引物进行多重PCR扩增，将PCR扩增产物与偶联在微球上的TAG序列进行杂交，检测MFI值，根据MFI值判定检测结果阴性或阳性。该方法提高了检测的特异性和灵敏度，实现了对猪病毒性腹泻多重病原的定性定量检测，具有高通量、省时省力、特异性强、灵敏度高等诸多的优势，能满足同时进行多种病原检测的需求。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建。

背景技术

由病毒引起的猪腹泻疫病流行范围广，仔猪发病率高，死亡率可高达100％。而且多病原感染、协同感染较为普遍。临床很难确定主要诱发病因，给诊断和控制带来困难。

引起猪腹泻的主要病毒有猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacorona virus，PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪捷申病毒(Porcineteschvirus，PTV)、牛病毒毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)、猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus，PSV)、猪嵴病毒(Porcine kobuvirus，PKV)、猪星状病毒(Porcine astrovirus，PAstV)、猪环曲病毒(Porcine torovirus，PToV)、猪札幌病毒(Porcine Sapovirus，PSaV)等，这些病毒引起不成程度腹泻，在多个病原共同感染情况下，可导致严重腹泻及猪只死亡。

目前，关于猪病毒性腹泻病原的检测研究最多的是多重PCR方法，但大多是2重或3重PCR方法。焦洋等(猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立，动物医学进展，2013，34(08)：71-75)建立了针对PEDV、TGEV和PBoV的3重PCR检测方法。

陈小芬等(PEDV/TGEV/PDCoV快速检测方法的建立及PEDV COE基因和ORF3基因遗传变异研究，华南农业大学，2016.)针对PEDV、TGEV和PDCoV，建立了三重RT-PCR检测方法。

刘高鹏(多重PCR检测和鉴定五种猪腹泻病毒研究，浙江理工大学，2017)建立了针对PEDV、TGEV、猪轮状病毒A型(Porcine group A rotavi ruses,GAR)、猪轮状病毒C型(Porcine group C rotaviruses，GCR)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)的5重实时荧光定量PCR方法，检测172份临床样品，发现GCR、GAR、TGEV、PEDV和PCV2阳性率分别为5.81％、2.32％、8.72％、20.92％和46.51％，总混合感染率为22.09％。

但是，这些现有技术中，常规单重RT-PCR能够检测低至0.1pg的病毒RNA，而多重RT-PCR随着检测病原数量的增加，灵敏度下降十分明显。鉴于这种灵敏度的局限性，其检测病原范围也很有限。

近年来，Luminex检测得到了广泛应用，根据各病原序列，设计合适的检测引物，并根据检测引物扩增的目标序列，设计特异性探针；进一步在微球上偶联探针序列，通过探针与目标序列之间的杂交，最后在检测MFI值。该方法中，探针序列需要自行设计，随着病原数量的增加，探针设计难度也增加，导致探针特异性不强；而且微球偶联过程中，又增加了人为的不确定因素，导致试验误差增加。

发明内容