[发明专利]一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建

权利要求书

1.一种区分猪的PTV、PKOV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV、PoRV、PEDV、BVDV和TGEV病毒的多重液相芯片检测方法，用于非疾病的诊断与治疗目的，包括以下步骤：

1)分别根据猪的PTV、PKOV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV、PoRV、PEDV、BVDV或TGEV病毒基因序列，设计扩增所述病毒的PCR引物，所述PCR引物包括上游引物和下游引物；

其中，猪的PTV、PKOV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV、PoRV、PEDV、BVDV和TGEV病毒的PCR引物序列如下，从5’到3’：PToV上游引物：AATTGCTTATTGGTGGCTTC；

下游引物：AGCDATTTGRGCDGCATTC；

PDCoV上游引物：CGCAGTTTTCATTGTGTCCA；

下游引物：CCTGTGGCGGATTTCTAACT；

PAstV上游引物：CCTTWCCCCACTGATGAAGA；

下游引物：CCTGTCCATCTGCCTTTCTGT；

PKoV上游引物：CGCCGTTCACTCTTTGTCC；

下游引物：ACCAAGCAGCATCCTACCAG；

PSV上游引物：CTGGACTGGGCCTATACT；

下游引物：TYAGGTACACACGGGCTC；

PTV上游引物：TGCAGCTCTTTCACATTTRGA；

下游引物：ACTTGTATGAGGCCCATCG；

PSaV上游引物：GTGGCAACGTACAAYGCRTGG；

下游引物：GCCTCCATCACGAACACT；

BVDV上游引物：AGCCATGCCCHTAGTAGGAC；

下游引物：CCTCTGCWRCACCCTATC；

PEDV上游引物：GTCAAGATGGCTATTCTATGG；

下游引物：ACCAAGAATGTGTCCTGCG；

TGEV上游引物：CAAAGGAATAGGTAACAGGG；

下游引物：ATCTGCATGAGGTCCAGT；

PoRV上游引物：GGATTACTTGGYACTACTTT；

下游引物：AATGATGCTGAYTATGGAAGT；

2)根据所述病毒的基因序列，选择合适的TAG序列，将TAG序列偶联于对应的微球上；将TAG互补序列标记于PCR上游引物5’端，TAG互补序列和PCR上游引物之间有12个碳原子的臂距；在PCR下游引物5’端标记生物素，获得修饰引物；

所述猪的PTV、PKOV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV、PoRV、PEDV、BVDV和TGEV病毒的TAG序列如下，从5’到3’：

PToV-TAG：TTGAAAGAGAGAGATAAGAATAAA；

PDCoV-TAG：GATAGTAAATAGAGAAAGAGTTAA；

PAstV-TAG：GTTAAATGTAAAGTGAAAGAATAG；

PKoV-TAG：AGTAGTGAAAGAAATGAAATGTAA；

PSV-TAG：TTAAAGAAGAGAAAGAAAGTGTTA；

PTV-TAG：TGTGAGTAAATTGTGATAAAGTAA；

PSaV-TAG：TGTTTATAGATTGATGATAGTGTT；

BVDV-TAG：TATGAAATGTTTGTTTATTGTGTG；

PEDV-TAG：GAAAGAGTATGAAAGTTGATTAAA；

TGEV-TAG：AATTGTTGAATATGTTTGTGTTTG；

PoRV-TAG：GTATTAGTTAAAGTTGAAAGATGA；

3)提取样品RNA，反转录获得cDNA；

4)以步骤3)的cDNA为模板，利用修饰引物进行多重PCR扩增，退火温度50～58℃，获得多重PCR扩增产物；

5)步骤4)获得的扩增产物与偶联在微球上的TAG序列进行杂交，40～45℃反应20～30min，设阴性对照，检测杂交反应液，分别获得样品及阴性对照的MFI值，根据MFI值，进而确定cMFI值；当cMFI≥3时，结果判定为阳性，否则为阴性；

其中，cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)。