[发明专利]脐带间充质干细胞培养上清的低温冷藏保存方法

摘要

脐带间充质干细胞培养上清的低温冷藏保存方法，属于脐带间充质干细胞保存技术领域。取足月健康新生儿脐带，经过检查鉴定可用，然后进行分离、培养、饥饿培养，制备干细胞培养上清，最后加入白花檵木提取物保护液于0‑8℃条件下低温冷藏，本发明的保护方法确保脐带间充质干细胞培养上清在低温(0‑8℃)条件下保存15天，干细胞上清中的总蛋白质含量基本不变，且EGF、VEGF和TNF‑α含量均没有明显改变，延长干细胞上清液在低温条件下的存放时间，降低保存和运输成本。

主权项

1.一种脐带间充质干细胞培养上清低温保存方法，其特征在于，步骤如下：(1)取足月健康胎儿脐带，用荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗‑HCV,抗‑HDV,抗‑HEV,抗‑HIV‑1/2,HCV‑RNA,HIV‑1‑RNA,CMV‑DNA,检测结果均为阴性可用(2)将手术室取出的脐带放入装有生理盐水的无菌培养瓶中，4℃保存或运输至无菌实验室；入细胞培养室后，去除细胞培养瓶瓶口处的封口塑料，后放入处于运行状态的洁净台中；(3)从4℃的冰箱中取出DMEM培养基，FBS,使其慢慢恢复至室温；(4)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；(5)组织块制备剪切脐带华通氏胶：将步骤(4)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1‑5mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；(6)接种将步骤(5)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；(7)脐带华通氏胶的培养平置步骤(6)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6‑12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有5％‑10％胎牛血清的基础培养基(DMEM培养基)，然后缓慢让它浸润整个组织块；培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；(8)换液第一次换液：步骤(7)脐带华通氏胶培养到第5天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有5％‑10％胎牛血清的培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；第二次换液：脐带华通氏胶培养到10天后，重复第一次换液的操作；(9)收获原代细胞细胞观察：脐带华通氏胶培养到,14‑16天后，将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％‑80％时，即可进行消化收获；(10)原代细胞收获配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液；去除旧的培养液：摇晃培养瓶并用移液器吹打，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入含有胎牛血清的DMEM培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管中离心；(10)原代细胞传代(P0传P1)将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有胎牛血清的DMEM培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有胎牛血清的DMEM培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80‑90％；(11)干细胞培养上清根据步骤(9)‑(10)，细胞传代至第四代P4；除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2‑3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水液，加入DMEM培养基，饥饿培养48小时；(12)保存吸出收集培养瓶中饥饿培养48小时后的干细胞培养上清，进行离心，弃沉淀，收集干细胞培养上清，用5KD透析袋进行浓缩，浓缩，获取分子量在5000以上的干细胞分泌因子；在上述浓缩后的干细胞培养上清中加入质量百分比浓度0.5‑5％的白花檵木提取物的DMEM培养基作为干细胞培养上清的保护剂，放入0‑8℃的冰箱保存。