[发明专利]脐带间充质干细胞培养上清的低温冷藏保存方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞培养上清低温保存方法，其特征在于，步骤如下：

(1)取足月健康胎儿脐带，用荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV,抗-HDV,抗-HEV,抗-HIV-1/2,HCV-RNA,HIV-1-RNA,CMV-DNA,检测结果均为阴性可用

(2)将手术室取出的脐带放入装有生理盐水的无菌培养瓶中，4℃保存或运输至无菌实验室；入细胞培养室后，去除细胞培养瓶瓶口处的封口塑料，后放入处于运行状态的洁净台中；

(3)从4℃的冰箱中取出DMEM培养基，FBS,使其慢慢恢复至室温；

(4)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；

(5)组织块制备

剪切脐带华通氏胶：将步骤(4)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-5mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；

(6)接种

将步骤(5)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；

(7)脐带华通氏胶的培养

平置步骤(6)接种培养瓶，放置于CO₂培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有5％-10％胎牛血清的基础培养基(DMEM培养基)，然后缓慢让它浸润整个组织块；

培养条件：37.0±0.5℃，CO₂浓度为5.0±0.2％；

(8)换液

第一次换液：步骤(7)脐带华通氏胶培养到第5天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有5％-10％胎牛血清的培养基，平置培养瓶，放置到从CO₂培养箱中继续培养；

第二次换液：脐带华通氏胶培养到10天后，重复第一次换液的操作；

(9)收获原代细胞

细胞观察：脐带华通氏胶培养到,14-16天后，将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；

(10)原代细胞收获

配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液；

去除旧的培养液：摇晃培养瓶并用移液器吹打，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；

洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；

消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；

终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入含有胎牛血清的DMEM培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管中离心；

(10)原代细胞传代(P0传P1)

将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有胎牛血清的DMEM培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；

将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有胎牛血清的DMEM培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO₂培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO₂浓度，培养至细胞融合度达到80-90％；

(11)干细胞培养上清

根据步骤(9)-(10)，细胞传代至第四代P4；

除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水液，加入DMEM培养基，饥饿培养48小时；

(12)保存

吸出收集培养瓶中饥饿培养48小时后的干细胞培养上清，进行离心，弃沉淀，收集干细胞培养上清，用5KD透析袋进行浓缩，浓缩，获取分子量在5000以上的干细胞分泌因子；在上述浓缩后的干细胞培养上清中加入质量百分比浓度0.5-5％的白花檵木提取物的DMEM培养基作为干细胞培养上清的保护剂，放入0-8℃的冰箱保存。

2.按照权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞培养上清低温保存方法，其特征在于，脐带华通氏胶的剥离并洗涤：在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤。