[发明专利]脐带间充质干细胞培养上清的低温冷藏保存方法

说明书

脐带间充质干细胞培养上清的低温冷藏保存方法，属于脐带间充质干细胞保存技术领域。取足月健康新生儿脐带，经过检查鉴定可用，然后进行分离、培养、饥饿培养，制备干细胞培养上清，最后加入白花檵木提取物保护液于0‑8℃条件下低温冷藏，本发明的保护方法确保脐带间充质干细胞培养上清在低温(0‑8℃)条件下保存15天，干细胞上清中的总蛋白质含量基本不变，且EGF、VEGF和TNF‑α含量均没有明显改变，延长干细胞上清液在低温条件下的存放时间，降低保存和运输成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域涉及一种脐带间充质干细胞培养上清冷藏保存方法，属于脐带间充质干细胞保存技术领域。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)最早发现于1968年是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有易于采集和分离、免疫原性低、分化及旁分泌能力强、造血支持等特点而日益受到人们的关注。

间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复

脐带间充质干细胞是从人脐带组织中的沃顿胶分离培养获得的一种来源的间充质干细胞，流式细胞仪检测结果显示，贴壁细胞均表达CD44、CD29，低表达CD106，不表达造血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，也不表达HLA-DR，具有和骨髓、胎盘羊膜以及脂肪组织来源的间充质干细胞一样的表面抗原。

脐带间充质干细胞(MSCs)具有多向分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。研究报道从人脐带中分离出MSCs，无论细胞含量、增殖能力还是分化能力均优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。干细胞的培养体系主要采用含动物血清(如胎牛血清)或无血清的培养基(无血清便于临床研究)，对脐带沃顿胶组织进行贴壁扩增培养间充质干细胞，同时研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、免疫表型等特性(详见图1和2)，旨在建立脐带间充质干细胞的富集方法，为建立脐带间充质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种脐带间充质干细胞培养上清低温(0-8℃)的保存方法，延长其保存时间。

本发明采取的方案是：一种脐带间充质干细胞培养上清低温(0-8℃)保存方法步骤如下：

(1)取足月健康胎儿脐带，用荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV,抗-HDV,抗-HEV,抗-HIV-1/2,HCV-RNA,HIV-1-RNA,CMV-DNA,检测结果均为阴性可用

(2)将手术室取出的脐带放入装有生理盐水的无菌培养瓶中，4℃保存或运输至无菌实验室；入细胞培养室后，去除细胞培养瓶瓶口处的封口塑料，后放入处于运行状态的洁净台中。

(3)从4℃的冰箱中取出DMEM培养基，FBS,使其慢慢恢复至室温。

(4)脐带华通氏胶的剥离并洗涤

优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；

(5)组织块制备

剪切脐带华通氏胶：将步骤(4)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-5mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；

(6)接种