[发明专利]一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用有效
| 申请号： | 201810537614.1 | 申请日： | 2018-05-30 |
| 公开（公告）号： | CN108624546B | 公开（公告）日： | 2019-12-13 |
| 发明（设计）人： | 徐虹;沙媛媛;李莎;许宗奇;冯小海;邱益彬;张亚涛 | 申请（专利权）人： | 南京工业大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/55;C12N15/75;C12N15/65;C12N15/66;C12P13/02;C12R1/07 |
| 代理公司： | 32204 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) | 代理人： | 肖明芳 |
| 地址： | 210000 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，以消除内源质粒的解淀粉芽孢杆菌为宿主菌，将聚谷氨酸降解酶基因pgdS插入pNX01载体的Spe I和Not I酶切位点之间得到重组质粒，再将重组质粒导入宿主菌中，即得。本发明还公开了所述构建方法构建得到的重组解淀粉芽孢杆菌及其在发酵产γ‑聚谷氨酸中的应用。本发明将发酵生产γ‑PGA和聚谷氨酸降解酶过程相偶联，实现一步发酵直接获取低分子量γ‑PGA和聚谷氨酸降解酶两种产物，在产高分子γ‑PGA的过程中，γ‑PGA被同时分泌到胞外的聚谷氨酸降解酶水解，避免了外源添加降解酶的繁琐，简化了生产工艺，一步发酵合成低分子聚谷氨酸。 | ||
| 搜索关键词： | 聚谷氨酸 降解酶 重组解淀粉芽孢杆菌 构建 一步发酵 重组质粒 宿主菌 发酵 解淀粉芽孢杆菌 降解酶基因 低分子量 酶切位点 内源质粒 直接获取 低分子 偶联 水解 外源 生产工艺 分泌 应用 合成 生产 | ||
【主权项】：
1.一种重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，以消除内源质粒的解淀粉芽孢杆菌为宿主菌，将聚谷氨酸降解酶基因pgdS插入pNX01载体的Spe I和Not I酶切位点之间得到重组质粒，再将重组质粒导入宿主菌中，即得；/n所述宿主菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NB，其由解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016346消除内源质粒p2Sip得到；/n所述聚谷氨酸降解酶基因pgdS的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；/n所述pNX01载体由载体骨架1、载体骨架2和载体骨架3依次连接得到，所述载体骨架1包括依次连接的大肠杆菌复制原点ori-177和氨苄青霉素筛选标记Amp，载体骨架1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述载体骨架2包括依次连接的解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M2016346内源质粒的复制蛋白rep和氯霉素筛选标记Cm，载体骨架2的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示；所述载体骨架3包括依次连接的启动子、多克隆位点MCS和淀粉酶的终止子Tamy，所述多克隆位点MCS从上游到下游依次包括酶切位点Spe I、EcoR I、Sal I、Bgl II和NotI；/n所述载体骨架3中的启动子为Pxyl启动子，所述Pxyl启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示，所述载体骨架3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。/n
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