[发明专利]一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，以消除内源质粒的解淀粉芽孢杆菌为宿主菌，将聚谷氨酸降解酶基因pgdS插入pNX01载体的Spe I和Not I酶切位点之间得到重组质粒，再将重组质粒导入宿主菌中，即得。本发明还公开了所述构建方法构建得到的重组解淀粉芽孢杆菌及其在发酵产γ‑聚谷氨酸中的应用。本发明将发酵生产γ‑PGA和聚谷氨酸降解酶过程相偶联，实现一步发酵直接获取低分子量γ‑PGA和聚谷氨酸降解酶两种产物，在产高分子γ‑PGA的过程中，γ‑PGA被同时分泌到胞外的聚谷氨酸降解酶水解，避免了外源添加降解酶的繁琐，简化了生产工艺，一步发酵合成低分子聚谷氨酸。

技术领域

本发明涉及解淀粉芽孢杆菌，具体涉及一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由D/L-谷氨酸单体通过γ-谷氨酰胺键聚合而成的一类均聚氨基酸，其独特的分子结构赋予其优良的理化性质，如水溶性、生物相溶性、生物可降解性及可食用性等等，目前已被广泛用于食品、农业、化妆品、医药、水处理等多个领域。γ-PGA作为一种谷氨酸聚合物，分子量是影响其生物学性能的重要参数，不同的用途对γ-PGA分子量的需求不同。近年来研究发现，低分子的聚谷氨酸(Mw<500kDa)具有独特的生理学性质，尤其在化妆品及医药领域体现出更大的优势。研究表明，低分子量的γ-PGA更易渗透肌肤底层，发挥保湿、维持肌肤弹性、美白肤色及促进营养成分吸收等功效；分子量在20-60kDa的γ-PGA作为药物载体，更易使药物渗透到达作用位点，与药物结合形成稳定结构，从而提高药物作用效果。由此可见，低分子量γ-PGA具有广阔的应用前景。

随着对小分子γ-PGA的研究以及应用的兴起，近年来，国内外开始重视对低分子量γ-PGA的制备研究。目前，γ-PGA的降解方法主要有物理降解、化学降解和生物酶降解。物理降解方法主要有高温、机械剪切力、超声波、紫外辐射等，制备的γ-PGA分子量范围分布较广，稳定性不佳；化学降解方法主要是通过添加酸(HCl)或碱(NaOH)水解γ-PGA，虽然水解效率高，但是外源引入化学试剂，影响γ-PGA的性质，对产品的纯化增加难度，并且易对环境造成污染；生物酶法是利用聚谷氨酸降解酶特异性地作用于γ-PGA的γ-谷氨酰胺键，使其键断裂而发生降解，反应条件较为温和，但是需要额外制备大量的聚谷氨酸降解酶以及控制反应条件，目前商品化的聚谷氨酸降解酶较少且价格昂贵，不适用于工业化制备小分子γ-PGA。因此，现在迫切需要找到一种适用于γ-PGA的降解方法。

随着日益加剧的能源危机与环境污染问题，开发可持续再生的非粮生物质能源是满足现代工业化生产需求的必经之路。菊芋作为一种新型的廉价非粮作物，抗逆性极强，可种植于沙漠、滩涂、盐碱荒地等边际性土地，缓解了我国耕地面积匮乏的现状；并且其茎块中富含大量的菊粉，经水解后主要转化为果糖，可作为发酵与生物转化的碳源，目前已被广泛用于乙醇、乳酸及2，3-丁二醇等产物的工业化制备。然而，目前大多数生物过程无法实现直接利用菊粉进行相关产物的合成，均需经过预水解或外源菊粉酶的协助，极大增加了工业化生产成本。因此，挖掘可直接高效利用菊粉的微生物体系，对于众多高附加值产物的合成意义重大。

发明内容

发明目的：为了解决现有生物酶法制备小分子γ-PGA使用的聚谷氨酸降解酶较少且价格昂贵的问题，本发明第一方面提供了一种重组解淀粉芽孢杆菌，可分泌聚谷氨酸降解酶并用于生产低分子量聚谷氨酸；本发明第二方面提供了重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，本发明第三方面提供了重组解淀粉芽孢杆菌的应用。

技术方案：本发明所述一种重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，以消除内源质粒的解淀粉芽孢杆菌为宿主菌，将聚谷氨酸降解酶基因pgdS插入pNX01载体的Spe I和Not I酶切位点之间得到重组质粒，再将重组质粒导入宿主菌中，即得。