[发明专利]一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，以消除内源质粒的解淀粉芽孢杆菌为宿主菌，将聚谷氨酸降解酶基因pgdS插入pNX01载体的Spe I和Not I酶切位点之间得到重组质粒，再将重组质粒导入宿主菌中，即得；

所述宿主菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NB，其由解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016346消除内源质粒p2Sip得到；

所述聚谷氨酸降解酶基因pgdS的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

所述pNX01载体由载体骨架1、载体骨架2和载体骨架3依次连接得到，所述载体骨架1包括依次连接的大肠杆菌复制原点ori-177和氨苄青霉素筛选标记Amp，载体骨架1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述载体骨架2包括依次连接的解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M2016346内源质粒的复制蛋白rep和氯霉素筛选标记Cm，载体骨架2的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示；所述载体骨架3包括依次连接的启动子、多克隆位点MCS和淀粉酶的终止子Tamy，所述多克隆位点MCS从上游到下游依次包括酶切位点Spe I、EcoR I、Sal I、Bgl II和NotI；

所述载体骨架3中的启动子为Pxyl启动子，所述Pxyl启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示，所述载体骨架3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、构建pNX01载体：

a1以穿梭质粒pHY300PLK为模板通过PCR扩增得到载体骨架1；

a2以解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016346的内源质粒p2Sip为模板通过PCR扩增得到复制蛋白rep，以穿梭质粒pKSV7为模板通过PCR扩增得到氯霉素筛选标记Cm，以复制蛋白rep和氯霉素筛选标记Cm为模板进行重叠延伸PCR，得到载体骨架2；

a3以B.subtilis 168的基因组为模板通过PCR扩增得到Pxyl启动子，以解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016346的基因组为模板扩增得到淀粉酶的终止子Tamy，以Pxyl启动子和淀粉酶的终止子Tamy为模板进行重叠延伸PCR，多克隆位点MCS的序列融合设计在引物Pxyl-F和Tamy-R中，得到载体骨架3；

a4将载体骨架1、载体骨架2和载体骨架3利用多片段一步克隆法依次连接，得到pNX01载体；

B、构建重组质粒pNX01-pgdS：以B.subtilis NX-2基因组为模板通过PCR扩增得到聚谷氨酸降解酶基因pgdS，其上下游分别引入酶切位点Spe I、Not I；将步骤A得到的pNX01载体进行Spe I、Not I双酶切，利用一步克隆的方法，将聚谷氨酸降解酶基因pgdS和双酶切得到的质粒连接，得到重组质粒pNX01-pgdS；

C、构建重组解淀粉芽孢杆菌：将步骤B得到的重组质粒pNX01-pgdS转化至大肠杆菌E.coli GM2163中进行去甲基化dam^-、dCm^-，再将去甲基化的重组质粒pNX01-pgdS转化至宿主菌中，即得。

3.权利要求1-2任意一项所述构建方法构建得到的重组解淀粉芽孢杆菌。

4.权利要求3所述重组解淀粉芽孢杆菌在发酵产γ-聚谷氨酸中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养基的配方如下：菊粉粗提液30-80g/L，硫酸铵1-10g/L，三水合磷酸氢二钾5-30g/L，磷酸二氢钾0.1-10g/L，无水硫酸镁0.1-5g/L，一水硫酸锰0.01-0.1g/L；在30-40℃发酵培养第0-24h时，添加5-20g/L的木糖诱导聚谷氨酸降解酶基因pgdS的表达，控制发酵培养时间为48-100h；通过控制木糖的浓度和木糖的添加时间控制聚谷氨酸降解酶基因pgdS的表达量，获取不同分子量范围的小分子γ-聚谷氨酸。