[发明专利]一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法

摘要

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法，属于酶工程领域。本发明通过在目的基因N端加入不同信号肽的策略，构建重组分泌表达质粒,并在枯草芽孢杆菌表达系统中进行表达，筛选到PhoD信号肽效果最佳，提高了亮氨酸脱氢酶分泌表达水平，为对照菌的2.2倍。此方法中枯草芽孢杆菌为安全菌株，重组蛋白直接分泌到胞外，使后期分离操作简单，更加适合工业化应用，为亮氨酸脱氢酶在医疗诊断等领域的应用提供了方便。 1

主权项

1.一种表达亮氨酸脱氢酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达载体上，然后在表达载体自身启动子和亮氨酸脱氢酶基因间加入信号肽序列，将构建的重组表达载体转化到宿主枯草芽孢杆菌中，得到枯草芽孢杆菌重组菌。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶基因来源于Bacillus cereus。

3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述信号肽序列为AmyQ、SacB或PhoD。

5.根据权利要求1或4所述的重组菌，其特征在于，所述信号肽序列为AmyQ、SacB和PhoD，所述AmyQ的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SacB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

6.根据权利要求1所述的的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建方法如下：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1的亮氨酸脱氢酶的基因与质粒pMA5进行连接，得到重组质粒pMA5‑leudh；

(2)将信号肽序列与重组质粒pMA5‑leudh通过酶切位点相连，得到重组质粒pMA5‑SP_N‑leudh；

(3)将重组质粒pMA5‑SP_N‑leudh转化枯草芽孢杆菌，得到枯草芽孢杆菌重组菌。

7.根据权利要求1或6所述的的重组菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168或Bacillus subtilis WB600。

8.根据权利要求1或6所述的的重组菌，其特征在于，所述信号肽序列为PhoD，所述PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

9.应用权利要求1‑8任一所述重组菌发酵生产亮氨酸脱氢酶的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

(1)将菌枯草芽孢杆菌重组菌在LB培养基中，35‑39℃振荡培养10‑16h，作为一级种子发酵液；

(2)将一级种子发酵液按照4‑5％接种到发酵培养液，35‑39℃振荡培养8‑12h，作为二级种子发酵液；

(3)将二级种子发酵液全部加入有发酵培养液的发酵罐中，在35‑39℃，溶氧控制在25‑35％条件下培养，全程用氨水以及磷酸进行pH值的调节，保持在6.8‑7.2；待碳源耗尽，即DO值迅速上升时，进行补料。

10.根据权利要9所述方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下成分：葡萄糖8‑10g/L，蛋白胨10‑12g/L，酵母粉22‑24g/L，酵母浸膏8‑10g/L，磷酸氢二钾11‑12.54g/L，磷酸二氢钾2.00‑2.31g/L，微量元素2‑3ml，加入卡纳至75‑100mg/L；所述补料配方为葡萄糖450‑500g/L，酵母提取物65‑75g/L。