[发明专利]一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法

权利要求书

1.一种表达亮氨酸脱氢酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将来源于Bacilluscereus的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶基因连接到表达载体pMA5上，然后在表达载体自身启动子和亮氨酸脱氢酶基因间加入信号肽序列，将构建的重组表达载体转化到宿主枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168中，得到枯草芽孢杆菌重组菌，所述信号肽序列为PhoD，所述PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一种权利要求1所述的重组菌的构建方法，其特征在于，所述重组菌的构建方法如下：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1的亮氨酸脱氢酶的基因与质粒pMA5进行连接，得到重组质粒pMA5-leudh；

(2)将信号肽序列与重组质粒pMA5-leudh通过酶切位点相连，得到重组质粒pMA5-SP_N-leudh；

(3)将重组质粒pMA5-SP_N-leudh转化枯草芽孢杆菌，得到枯草芽孢杆菌重组菌，所述信号肽序列为PhoD，所述PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.应用权利要求1所述重组菌发酵生产亮氨酸脱氢酶的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

(1)将菌枯草芽孢杆菌重组菌在LB培养基中，35-39℃振荡培养10-16h，作为一级种子发酵液；

(2)将一级种子发酵液按照4-5％接种到发酵培养液，35-39℃振荡培养8-12h，作为二级种子发酵液；

(3)将二级种子发酵液全部加入有发酵培养液的发酵罐中，在35-39℃，溶氧控制在25-35％条件下培养，全程用氨水以及磷酸进行pH值的调节，保持在6.8-7.2；待碳源耗尽，即DO值迅速上升时，进行补料。

4.根据权利要3所述方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下成分：葡萄糖8-10g/L，蛋白胨10-12g/L，酵母粉22-24g/L，酵母浸膏8-10g/L，磷酸氢二钾11-12.54g/L，磷酸二氢钾2.00-2.31g/L，微量元素2-3ml，加入卡纳至75-100mg/L；所述补料配方为葡萄糖450-500g/L，酵母提取物65-75g/L。