[发明专利]一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌发酵生产氨酸脱氢酶的方法，属于酶工程领域。本发明通过在目的基因N端加入不同信号肽的策略，构建重组分泌表达质粒,并在枯草芽孢杆菌表达系统中进行表达，筛选到PhoD信号肽效果最佳，提高了亮氨酸脱氢酶分泌表达水平，为对照菌的2.2倍。此方法中枯草芽孢杆菌为安全菌株，重组蛋白直接分泌到胞外，使后期分离操作简单，更加适合工业化应用，为亮氨酸脱氢酶在医疗诊断等领域的应用提供了方便。

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌发酵生产亮氨酸脱氢酶的方法，属于酶工程领域。

背景技术

亮氨酸脱氢酶(Leucine Dehydrogenase；EC 1.4.1.9；LeuDH)属于氧化还原酶类，以NAD⁺为辅酶，能可逆的催化L-亮氨酸及一些支链氨基酸产生相应的酮酸及其类似物，也可以催化α-酮酸还原成手性氨基酸。目前在多种细菌中均发现亮氨酸脱氢酶的存在，研究较多的亮氨酸脱氢酶主要来源于芽孢杆菌，且多为6-8个亚基的同源多聚体。

亮氨酸脱氢酶在医药等行业有广泛应用，可用于医药中间体手性氨基酸的生物催化；临床生化诊断上，可偶联尿酶测定血清或尿液中尿素含量，UV-LED法不受内源氨干扰，可辅助检测肾脏疾病，还可以测定支链氨基酸及测定血清中亮氨酸氨肽酶活性等。现有报道亮氨酸脱氢酶的生产方法为构建表达亮氨酸脱氢酶的大肠杆菌基因工程菌，基于亮氨酸脱氢酶在医药行业等方面的应用，对酶的安全性要求更高，有必要选择安全性更高表达宿主。相比大肠杆菌，B.subtilis具有不易形成包涵体、表达产物直接分泌到胞外，后期分离纯化便利等优点，有较好的工业生产应用基础。B.subtilis具有不易形成包涵体、表达产物直接分泌到胞外，后期分离纯化便利等优点，并且能从上游保证该酶生产的安全性，有较好的工业生产应用基础，并且目前还没有相关报道将亮氨酸脱氢酶在枯草芽孢杆菌中进行表达，因此，构建一种能够增加亮氨酸脱氢酶胞外分泌的枯草芽孢杆菌基因工程菌是有待研究的课题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种表达亮氨酸脱氢酶的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌是将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达载体上，然后在表达载体自身启动子和亮氨酸脱氢酶基因间加入信号肽序列，将构建的重组表达载体转化到枯草芽孢杆菌中，得到枯草芽孢杆菌重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶基因来源于Bacillus cereus。

在本发明的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述信号肽序列为AmyQ、SacB或PhoD。

在本发明的一种实施方式中，所述信号肽序列为AmyQ、SacB或PhoD，所述AmyQ的核苷酸序列SEQ ID NO.2，所述SacB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述，所述PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pMA5。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168或Bacillus subtilis WB600。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的制备方法：将亮氨酸脱氢酶连接到表达载体上，然后在表达载体自身启动子和亮氨酸脱氢酶基因间加入信号肽序列。

一种分泌亮氨酸脱氢酶枯草芽孢杆菌重组菌的构建方法，所述构建方法是：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1的亮氨酸脱氢酶的基因与质粒pMA5进行连接，得到重组质粒pMA5-leudh；

(2)将信号肽序列与重组质粒pMA5-leudh通过酶切位点相连，得到重组质粒pMA5-SP_N-leudh；