[发明专利]一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法，以腺相关病毒（Adeno‑associated virus，AAV）为载体，构建pAAV SDF‑1α‑V5，扩增重组AAV载体，培养神经嵴干细胞，AAV‑SDF‑1α转染神经嵴干细胞，促进脊髓损伤的修复。

主权项

1.一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）pAAV SDF‑1α‑V5的构建：采用梯度离心法分离骨髓基质细胞，在DMEM/F12培养液中培养传代，抽提试剂TRIzol提取总mRNA，RT‑PCR扩增SDF‑1α；将SDF‑1α插入pcDNA3.1/V5‑His‑TOPO构建pcDNA3.1‑SDF‑1α‑V5‑HIS；（2）重组AAV载体的扩增：在DMEM培养液Ⅰ中培养HEK 293细胞，当生长密度达到80%后，前病毒质粒、辅助质粒通过钙‑磷酸盐沉降法转染HEK 293细胞，8小时后改用DMEM培养液Ⅱ继续培养72小时，用0.5M EDTA消化后反复离心收集细胞，使细胞完全裂解，采用5μM MgCl2和1μl/ml的Benzonase于37℃消化30min后终止反应，去除裂解碎片，取上清液孵育30min，收集折射率1.368‑1.380的病毒悬液，‑80℃低温冷冻保存；（3）神经嵴干细胞的培养：新鲜分离的p75+P0‑孕14.5天的胎鼠坐骨神经培养神经嵴干细胞经过处理后溶解为单细胞悬液；冰上1/2000单克隆抗‑P0悬浮20min后藻红蛋白结合的抗小鼠IgG1二抗孵育，清洗后溶解于FITC直接结合的抗‑p75溶液，内含0.1 mg/mL小鼠IgG1，清洗后溶解于2μg/mL 7‑氨基放线菌素D染色液中，FACS选出p75+P0‑细胞待培养；NCSCs 以103/ml的细胞密度在预处理过的培养瓶中进行培养；（4）AAV‑SDF‑1α转染神经嵴干细胞：神经嵴干细胞体外增殖，105 vgc/cell浓度AAV SDF‑1α感染细胞，培养24h，加入0.1mg/ml 的DAPi后再培养1h，37℃ 0.25%胰蛋白酶消化5min，800rpm转离心5min，收获后置于冰上待用。