[发明专利]一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法，以腺相关病毒（Adeno‑associated virus，AAV）为载体，构建pAAV SDF‑1α‑V5，扩增重组AAV载体，培养神经嵴干细胞，AAV‑SDF‑1α转染神经嵴干细胞，促进脊髓损伤的修复。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法。

背景技术

脊髓损伤可造成患者躯体感觉、躯体运动及植物功能方面的功能障碍，其损伤机制在于以下三点，包括外力的直接损伤、骨折血肿等的间接压迫以及外伤后的缺血损害。

原发性脊髓损伤会造成神经元的死亡以及神经轴突的断裂，损伤部位出现神经元及胶质细胞的凋零或坏死，典型表现为中心区坏死，周围进行性的继发坏死萎缩。成年人脊髓的再生能力是有限的，因此多数情况下如发生不可逆损伤，患者是无法重新恢复功能的。因此如何促进脊髓神经的再生、减少残障的发生，是迫切需要研究的方向。神经干细胞可分泌多种神经营养因子、改善内环境，刺激轴突再生，作为治疗脊髓损伤的细胞移植选项之一，多年来广受关注。通过定向细胞培养，神经干细胞可分化为神经元、少突胶质细胞、星形细胞等其他类型成熟的神经细胞，移植到脊髓受损部位可以促进轴突的再生。当受损部位植入神经营养因子修饰的神经干细胞后，可改善局部内环境，分泌神经再生的必须因子，促进脊髓的重建。

脊髓的重塑需要两个必须因子，神经细胞及适应的内环境。神经干细胞广泛存在于生物中枢神经系统中，如海马、室管膜下区等。成人神经干细胞在各自的干细胞憩室中自我更新、活化并非对称性定向分化。应急状况下，骨髓中的多能干细胞可被动员迁徙到受伤部位。研究发现受伤部位周围星形细胞表达神经干细胞特定标记物巢蛋白，提示胶质细胞有可能在外伤后有能力分化为干细胞。

目前认为，趋化因子基质细胞衍生因子1（SDF-1）及其唯一受体CXCR4是诱导、动员干细胞归巢的重要因素。造血、肌卫星、肝卵圆及神经干/前体细胞分泌CXCR4并在外周血中保持低浓度表达，组织受伤或药物动员后可增加表达。SDF-1有两个亚型，SDF-1α和 SDF-1β。SDF-1是从属于间分泌CXC亚型的小细胞因子，最早在鼠类骨髓基质细胞系中分离出来。SDF-1α及SDF-1β的cDNA分别编码89个和93个氨基酸。

2002年Reiss报导软脑膜可分泌SDF-1，促进小脑外颗粒层神经干细胞的分裂增殖，是平衡内外颗粒层神经细胞迁徙的关键趋化因子。作为SDF-1的受体，CXCR4在外颗粒层神经干细胞表面表达，在最后内向迁徙的有丝分裂后的细胞表达缺失，他提出脑膜细胞是脑发育过程中SDF-1表达的重要因素，是吸引前体细胞迁徙至增殖部位的必要因素，SDF-1与CXCR4结合后，G 蛋白和音猬因子激活并促进神经干细胞的分裂。

2003年，通过对缺血性心肌病大鼠模型的研究，Askari发现SDF-1可诱导治疗性干细胞向受伤的心肌组织迁移，提示该因子在干细胞治疗受伤中的重要意义，可直接诱导干细胞的定向迁徙。2004年，Imitola报导中枢神经系统受损部位的定向迁徙是干细胞治疗的关键因素，通过非固定的通路直接向受损部位精确迁徙，休眠的神经干细胞在SDF-1的作用下分裂增殖，线状迁徙或转移至靶点。因此，趋化因子SDF-1在脊髓受伤部位的表达可以诱导更多干细胞向靶点的迁移，增强干细胞的分裂增殖能力，促进脊髓的修复。