[发明专利]一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）pAAV SDF-1α-V5的构建：采用梯度离心法分离骨髓基质细胞，在DMEM/F12培养液中培养传代，抽提试剂TRIzol提取总mRNA，RT-PCR扩增SDF-1α；将SDF-1α插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO构建pcDNA3.1-SDF-1α-V5-HIS；

（2）重组AAV载体的扩增：在DMEM培养液Ⅰ中培养HEK 293细胞，当生长密度达到80%后，前病毒质粒、辅助质粒通过钙-磷酸盐沉降法转染HEK 293细胞，8小时后改用DMEM培养液Ⅱ继续培养72小时，用0.5M EDTA消化后反复离心收集细胞，使细胞完全裂解，采用5μM MgCl₂和1μl/ml的Benzonase于37℃消化30min后终止反应，去除裂解碎片，取上清液孵育30min，收集折射率1.368-1.380的病毒悬液，-80℃低温冷冻保存；

（3）神经嵴干细胞的培养：新鲜分离的p75+P0-孕14.5天的胎鼠坐骨神经培养神经嵴干细胞经过处理后溶解为单细胞悬液；冰上1/2000单克隆抗-P0悬浮20min后藻红蛋白结合的抗小鼠IgG1二抗孵育，清洗后溶解于FITC直接结合的抗-p75溶液，内含0.1 mg/mL小鼠IgG1，清洗后溶解于2μg/mL 7-氨基放线菌素D染色液中，FACS选出p75+P0-细胞待培养；NCSCs 以10³/ml的细胞密度在预处理过的培养瓶中进行培养；

（4）AAV-SDF-1α转染神经嵴干细胞：神经嵴干细胞体外增殖，10⁵ vgc/cell浓度AAVSDF-1α感染细胞，培养24h，加入0.1mg/ml 的DAPi后再培养1h，37℃ 0.25%胰蛋白酶消化5min，800rpm转离心5min，收获后置于冰上待用。

2.根据权利要求1所述的一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法，其特征在于：步骤（1）中RT-PCR扩增SDF-1α上游引物为5’-CTCGAGGCCCACGCCATGGACGCCAAGGTC-3’，下游引物 为5’-CTTGTTTAAGGCTTTGTCCAGGTA-3’。

3.根据权利要求1或2所述的一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法，其特征在于：步骤（1）中对所有经PCR扩增的序列测序，排除PCR过程中可能出现的突变，并用限制性内切酶Xba I酶切电泳检验与理论值是否相符。

4.根据权利要求1所述的一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法，其特征在于：步骤（2）中DMEM培养液Ⅰ中含有10%胎牛血清和100U/ml青链霉素；DMEM培养液Ⅱ中含有2%胎牛血清和100U/ml青链霉素。

5.根据权利要求1或4所述的一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法，其特征在于：步骤（2）中采用干冰/乙醇和37℃水浴冻融3次使细胞完全裂解。

6.根据权利要求1或4所述的一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法，其特征在于：步骤（2）中上清液用0.4%脱氧胆酸37℃孵育30min，室温下38000rpm 3小时氯化铯梯度离心2次，收集折射率1.368-1.380的病毒悬液，Pierce透析盒HN缓冲液中置换氯化铯24小时，半透膜3000rpm离心浓缩30min，-80℃低温冷冻保存。

7.根据权利要求1所述的一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法，其特征在于：步骤（3）中解剖E14-E17胎鼠坐骨神经，显微镜下剥离神经外膜，在10 mM HEPES无钙镁HBSS冰溶液中用眼科镊子切碎，采用1 mg/mL III型胶原酶与0.25%胰蛋白酶 37°C共同消化4min，500rpm离心5min后再溶解为单细胞悬液。

8.根据权利要求1或7所述的一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法，其特征在于：步骤（3）中培养瓶采用多聚D-赖氨酸及0.15 mg/mL 纤维连接蛋白预先处理。

9.根据权利要求1或7所述的一种病毒基因载体转染的神经嵴干细胞的制备方法，其特征在于：步骤（3）中NCSCs培养在DMEM/F12培养液中加入20 ng/mL重组人bFGF，常规青霉素/链霉素， 1% N₂ 及2% B27添加剂，37℃下5% CO₂ NCSCs培养一周，每三天换半液。