[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡

摘要

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡。本发明采用荧光微球代替胶体金作为标记探针，制备了免疫荧光侧流层析试纸条，灵敏度较胶体金试纸条技术提升10倍以上。本发明提供的检测技术，既具备ELISA技术的高灵敏度优势，又具备胶体金试纸条技术的现场检测优势，利用便携式荧光免疫分析仪15min就能定量的检测出抗体滴度，现场进行不需要专业的培训和技能，测试操作方便，快速提供结果。本发明能切实解决目前猪繁殖与呼吸综合征疫情的检测及防控需求。

主权项

1.一种制备检测卡的方法，包括如下步骤：分别制备抗原蛋白A和抗原蛋白B；沿待测液体样本流动方向，将样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；标记垫上包被有荧光微球标记的一抗；检测垫上设置有检测线和质控线，检测线上包被有抗原蛋白A和抗原蛋白B，质控线上包被有二抗；所述一抗为抗猪IgG抗体；所述二抗为抗所述一抗的抗体；所述抗原蛋白A的制备方法包括如下步骤：将抗原蛋白A的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；培养所述重组菌，表达得到所述抗原蛋白A；所述抗原蛋白A的编码基因为序列表中序列1自5’端第97‑876位核苷酸所示的DNA分子；所述抗原蛋白B的制备方法包括如下步骤：将抗原蛋白B的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；培养所述重组菌，表达得到所述抗原蛋白B；所述抗原蛋白B的编码基因为序列表中序列3自5’端第97‑465位核苷酸所示的DNA分子所述检测垫上，每厘米检测线上附着有1μg所述抗原蛋白A和2μg所述抗原蛋白B；所述标记垫上，每厘米标记垫上附着有30μg所述一抗；所述荧光微球和所述一抗的质量比为1:100；所述检测线的印记方法具体为：将抗原蛋白A和抗原蛋白B按照蛋白含量1:2的比例混合后，得到混合蛋白溶液，将混合蛋白溶液的浓度调至1.5mg/mL后印迹于检测垫；所述检测垫上，每厘米质控线上附着有4μg所述二抗；所述质控线的印记方法具体为：将二抗溶液浓度调整至2 mg/mL后印迹于检测垫；所述检测垫的材质为玻璃纤维膜；所述荧光微球为羧基荧光微球；所述羧基荧光微球的粒径为300 nm，激发/发射为365/613nm；所述荧光微球标记的一抗的制备方法包括如下步骤：1、取100 μL羧基荧光微球溶液，加入500 μL BS‑T2，混匀，14000 r/min离心20 min，收集沉淀；采用500 μL BS‑T2重悬沉淀，14000 r/min离心20 min，收集沉淀；采用300 μL BS‑T1重悬沉淀；2、向步骤1的溶液中加入10 μL溶液A和10 μL溶液B，震荡混匀，避光反应15 min；14000rpm离心20min，收集沉淀采用500 μL BS‑T1重悬沉淀，14000rpm离心20min，收集沉淀；采用500 μL BS‑T2重悬沉淀；溶液A：浓度为2 mg/mL的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）水溶液；溶液B：浓度为4 mg/mL的N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）水溶液；3、向步骤2的溶液中加入100 μg羊抗猪IgG，震荡混匀，避光反应2h，加入15 μL 9%（质量百分含量）酪蛋白水溶液，震荡混匀，避光反应30min；14000rpm离心20min，收集沉淀采用500 μL BS‑T1重悬沉淀，14000rpm离心20min，收集沉淀；采用500 μL BS‑T1重悬沉淀，得到标记羊抗猪IgG的荧光微球溶液；所述BS‑T1为含有体积百分含量为0.25% Tween‑20的25 mM硼酸水溶液，所述BS‑T1的pH= 8.5；所述BS‑T2为含有体积百分含量为0.15% Tween‑20的25 mM硼酸水溶液，所述BS‑T2的pH= 8.5；所述标记垫的制备方法如下：（1）将玻璃纤维膜置于标记垫处理液中静置1min后取出，37℃烘干；（2）将以上任一所述荧光微球标记的一抗，以30μg所述一抗/cm的量喷涂到步骤（1）处理的玻璃纤维膜上，37℃烘干；所述标记垫处理液为含有体积百分含量为0.3 % BSA、质量百分含量为4 %蔗糖和体积百分含量为0.2 % Tween‑20的0.02 M Tris‑HCl缓冲液，所述标记垫处理液的pH=8.0。