[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡

权利要求书

1.一种制备检测卡的方法，包括如下步骤：

分别制备抗原蛋白A和抗原蛋白B；

沿待测液体样本流动方向，将样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；标记垫上包被有荧光微球标记的一抗；检测垫上设置有检测线和质控线，检测线上包被有抗原蛋白A和抗原蛋白B，质控线上包被有二抗；

所述一抗为抗猪IgG抗体；

所述二抗为抗所述一抗的抗体；

所述抗原蛋白A的制备方法包括如下步骤：将抗原蛋白A的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；培养所述重组菌，表达得到所述抗原蛋白A；

所述抗原蛋白A的编码基因为序列表中序列1自5’端第97-876位核苷酸所示的DNA分子；

所述抗原蛋白B的制备方法包括如下步骤：将抗原蛋白B的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；培养所述重组菌，表达得到所述抗原蛋白B；

所述抗原蛋白B的编码基因为序列表中序列3自5’端第97-465位核苷酸所示的DNA分子

所述检测垫上，每厘米检测线上附着有1μg所述抗原蛋白A和2μg所述抗原蛋白B；

所述标记垫上，每厘米标记垫上附着有30μg所述一抗；所述荧光微球和所述一抗的质量比为1:100；

所述检测线的印记方法具体为：将抗原蛋白A和抗原蛋白B按照蛋白含量1:2的比例混合后，得到混合蛋白溶液，将混合蛋白溶液的浓度调至1.5mg/mL后印迹于检测垫；

所述检测垫上，每厘米质控线上附着有4μg所述二抗；

所述质控线的印记方法具体为：将二抗溶液浓度调整至2 mg/mL后印迹于检测垫；

所述检测垫的材质为玻璃纤维膜；

所述荧光微球为羧基荧光微球；

所述羧基荧光微球的粒径为300 nm，激发/发射为365/613nm；

所述荧光微球标记的一抗的制备方法包括如下步骤：

1、取100 μL羧基荧光微球溶液，加入500 μL BS-T2，混匀，14000 r/min离心20 min，收集沉淀；采用500 μL BS-T2重悬沉淀，14000 r/min离心20 min，收集沉淀；采用300 μL BS-T1重悬沉淀；

2、向步骤1的溶液中加入10 μL溶液A和10 μL溶液B，震荡混匀，避光反应15 min；14000rpm离心20min，收集沉淀采用500 μL BS-T1重悬沉淀，14000rpm离心20min，收集沉淀；采用500 μL BS-T2重悬沉淀；

溶液A：浓度为2 mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）水溶液；

溶液B：浓度为4 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）水溶液；

3、向步骤2的溶液中加入100 μg羊抗猪IgG，震荡混匀，避光反应2h，加入15 μL 9%（质量百分含量）酪蛋白水溶液，震荡混匀，避光反应30min；14000rpm离心20min，收集沉淀采用500 μL BS-T1重悬沉淀，14000rpm离心20min，收集沉淀；采用500 μL BS-T1重悬沉淀，得到标记羊抗猪IgG的荧光微球溶液；

所述BS-T1为含有体积百分含量为0.25% Tween-20的25 mM硼酸水溶液，所述BS-T1的pH= 8.5；

所述BS-T2为含有体积百分含量为0.15% Tween-20的25 mM硼酸水溶液，所述BS-T2的pH= 8.5；

所述标记垫的制备方法如下：（1）将玻璃纤维膜置于标记垫处理液中静置1min后取出，37℃烘干；（2）将以上任一所述荧光微球标记的一抗，以30μg所述一抗/cm的量喷涂到步骤（1）处理的玻璃纤维膜上，37℃烘干；

所述标记垫处理液为含有体积百分含量为0.3 % BSA、质量百分含量为4 %蔗糖和体积百分含量为0.2 % Tween-20的0.02 M Tris-HCl缓冲液，所述标记垫处理液的pH=8.0。

2.权利要求1所述的方法制备得到的检测卡。

3.一种检测系统，由权利要求1或2所述的检测卡和荧光免疫分析仪组成；所述检测系统的用途为如下（1）-（3）中的至少一种：

（1）检测待测猪是否感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒；

（2）检测待测猪血清中是否具有猪繁殖与呼吸综合征病毒或其抗体；

（3）检测待测猪是否患有猪繁殖与呼吸综合征。