[发明专利]一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法

摘要

本发明公开了一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法。包括PCR引物设计、DNA模板制备、PCR扩增、产物检测步骤。本发明根据南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫的种类特异区序列设计了包含6条PCR引物用于上述3种根结线虫的种类鉴定，鉴定的稳定性好、准确性高；所设计的6条引物组合使用，可以实现1次PCR反应完成3种烟草根结线虫病病原线虫的同步检测，鉴定方便、省时；采用普通PCR仪和常规试剂，检测成本，利于推广应用；本发明包含设计了针对病根样品和土壤样品的DNA制备方法，可以以包括卵、幼虫和成虫在内的各发育阶段的根结线虫为对象进行种类鉴定，具有广泛的使用范围。

主权项

1.一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法，其特征在于包括PCR引物设计、DNA模板制备、PCR扩增、产物检测步骤，具体包括：A、PCR引物设计：根据南方根结线虫、花生根结线虫和抓哇根结线虫的种类特异性序列设计6条PCR引物，即TR1、TR2、TR3、TR4、TR5和TR6用于上述3种根结线虫PCR鉴定，其序列分别为：TR1：5'‑AAGCAAAAGACGAAGCACCAAAA‑3'TR2：5'‑GAGGATTCAGCTCCCCAGCAC‑3'TR3：5'‑GAGTACGGATTTGAAATACAGGG‑3'TR4：5'‑TGAATGCTATGCCATCAGGAG‑3'TR5：5'‑CGATTGAACTGAGCCCAGACT‑3'TR6：5'‑TTTATTCGCAAGACAACACCC‑3'；B、DNA模板制备：在检测烟草病根样品时：将病根样品表面的附着物去除，挑取根结线虫卵块或根结组织置于灭菌后的研钵中，加入液氮研磨成粉末转入离心管中，加入DNA提取缓冲液，置于50~60℃水浴保温50~70min，冷却至室温，用等体积的酚‑氯仿‑异戊醇混合溶剂和氯仿‑异戊醇混合溶剂依次抽提，取上清液加等体积的异丙醇沉淀，沉淀经体积百分浓度60~80%的乙醇溶液清洗并干燥后，溶于灭菌纯净水中，调节DNA浓度值50ng/μl，得到用于PCR检测的DNA模板制备液；在检测样品为烟草根际土壤时：取土壤样品采用常规方法进行土壤线虫分离，将得到的线虫悬浮液置于解剖镜下观察，挑取其中疑似根结线虫二龄幼虫或雄成虫的线虫2~3条至10μl的100ng/μ的蛋白酶K溶液中，用解剖针将线虫切断，60℃水浴1h后95℃加热10min，冷却至室温即得用于PCR检测的DNA模板制备液；C、PCR扩增：以用于PCR检测的DNA模板制备液进行PCR扩增得到PCR扩增产物；D、产物检测：取5~10μl的PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳电泳，结束后经溴化乙锭染色后再紫外透射仪下观察，如检测到分子量为700bp的电泳谱带表明受检样品中含有南方根结线虫，如检测到分子量为260bp的电泳谱带表明受检样品含有花生根结线虫，如检测到分子量为570bp的电泳谱带表明受检样品中含有爪哇根结线虫。