[发明专利]一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法

权利要求书

1.一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法，其特征在于，包括PCR引物设计、DNA模板制备、PCR扩增、产物检测步骤，具体包括：

A、PCR引物设计：根据南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫的种类特异性序列设计6条PCR引物，即TR1、TR2、TR3、TR4、TR5和TR6用于上述3种根结线虫PCR鉴定，其序列分别为：

TR1：5'-AAGCAAAAGACGAAGCACCAAAA-3'

TR2：5'-GAGGATTCAGCTCCCCAGCAC-3'

TR3：5'-GAGTACGGATTTGAAATACAGGG-3'

TR4：5'-TGAATGCTATGCCATCAGGAG-3'

TR5：5'-CGATTGAACTGAGCCCAGACT-3'

TR6：5'-TTTATTCGCAAGACAACACCC-3'；

B、DNA模板制备：

在检测烟草病根样品时：将病根样品表面的附着物去除，挑取根结线虫卵块或根结组织置于灭菌后的研钵中，加入液氮研磨成粉末转入离心管中，加入DNA提取缓冲液，置于50~60℃水浴保温50~70min，冷却至室温，用等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂和氯仿-异戊醇混合溶剂依次抽提，取上清液加等体积的异丙醇沉淀，沉淀经体积百分浓度60~80%的乙醇溶液清洗并干燥后，溶于灭菌纯净水中，调节DNA浓度值50ng/μl，得到用于PCR检测的DNA模板制备液；

在检测样品为烟草根际土壤时：取土壤样品采用常规方法进行土壤线虫分离，将得到的线虫悬浮液置于解剖镜下观察，挑取其中疑似根结线虫二龄幼虫或雄成虫的线虫2~3条至10μl的100ng/μ的蛋白酶K溶液中，用解剖针将线虫切断，60℃水浴1h后95℃加热10min，冷却至室温即得用于PCR检测的DNA模板制备液；

C、PCR扩增：以用于PCR检测的DNA模板制备液进行PCR扩增得到PCR扩增产物；PCR反应体系为1×PCR buffer，1U Taq酶，0.2mM dNTPs，以及引物TR1、TR2、TR3、TR4、TR5和TR6各0.4μM的25μl PCR反应体系，PCR反应条件为预变性94℃ 2min；30个循环，每个循环包括：94℃ 45s，52℃ 60s，72℃ 90s；最后再72℃延伸10min；

D、产物检测：取5~10μl的PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳电泳，结束后经溴化乙锭染色后再紫外透射仪下观察，如检测到分子量为700bp的电泳谱带表明受检样品中含有南方根结线虫，如检测到分子量为260bp的电泳谱带表明受检样品含有花生根结线虫，如检测到分子量为570bp的电泳谱带表明受检样品中含有爪哇根结线虫。

2.根据权利要求1所述的烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法，其特征在于，B步骤中所述的DNA提取缓冲液为200mmol/L Tris-HCl pH＝8.5，250mmol/LNaCl， 25mmol/L EDTA，0.5%SDS组成。

3.根据权利要求1所述的烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法，其特征在于，B步骤中所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂中酚、氯仿和异戊醇的体积配比为25:24:1。

4.根据权利要求1所述的烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法，其特征在于，B步骤中所述的氯仿-异戊醇混合溶剂中氯仿和异戊醇的体积配比为24:1。