[发明专利]一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法

说明书

本发明公开了一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法。包括PCR引物设计、DNA模板制备、PCR扩增、产物检测步骤。本发明根据南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫的种类特异区序列设计了包含6条PCR引物用于上述3种根结线虫的种类鉴定，鉴定的稳定性好、准确性高；所设计的6条引物组合使用，可以实现1次PCR反应完成3种烟草根结线虫病病原线虫的同步检测，鉴定方便、省时；采用普通PCR仪和常规试剂，检测成本，利于推广应用；本发明包含设计了针对病根样品和土壤样品的DNA制备方法，可以以包括卵、幼虫和成虫在内的各发育阶段的根结线虫为对象进行种类鉴定，具有广泛的使用范围。

技术领域

本发明属于植物病害病原检测技术领域，具体涉及一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法。

背景技术

根结线虫（Meloidogyne spp．）是植物病原线虫中种类最多、分布最广和危害最严重的一类线虫。这类线虫主要以土壤传播的形式，危害植物的根系，使受害植物的根部形成肿瘤状的根结，从而发生严重影响植物正常生长发育的根结线虫病，已知受根结线虫病危害的植物主要包括茄科、豆科、葫芦科、禾本科、伞形花科等3000多种，在温带、亚热带和热带地区的植物受害尤其严重。其中尤以烟草受根结线虫危害最为严重，据联合国粮农组织估计，发达国家因根结线虫造成的烟草损失平均每年为4%，全世界的平均损失估计为10%，发展中国家的损失超过25%。在我国自20世纪80年代中后期以来，烟草根结线虫病病区不断扩大，危害加重，在河南、山东、云南、贵州、四川、湖北等烟区发生较为普遍，危害较重，病区发病率一般为70%~100%，重者达90%以上，减产30%~70%，成为了我国烟草生产上的主要病害。

根结线虫属于土壤习居性生物，由于受到土壤环境的限制外部施加的物理、化学因素很难对根结线虫起作用，尤其是近年来，用于根结线虫病防治的多数化学杀线虫剂存在高毒、高残留的弊端，已在世界范围内被普遍禁用。因此采取安全高效的根结线虫病防控方法已成为大势所趋。在烟草根结线虫病的防控过程中，选择采用合适的抗病烟草品种被认为是一项经济、高效、绿色的措施。然而，根结线虫种类繁多，不同根结线虫对寄主植物的致病能力不同，抗病品种对根结线虫的抗性范围也有限，当前国内烟草上分布最广泛危害最严重的根结线虫主要是花生根结线虫（Meloidogyne arenaria）、南方根结线虫（M. incognita）和爪哇根结线虫（M. javanica），这三种根结线虫的形态和分子生物学特征极为相似，但对不同烟草品种存在较大的致病性差异。因此准确、快速鉴定上述三种根结线虫是选育和利用抗病烟草品种的前提条件。

鉴定根结线虫种类最常用的方法是形态学方法，该方法通过显微操作方法切割根结线虫雌成虫会阴区角质膜，在显微镜下观察会阴区花纹的差异来确定根结线虫的种类。这种方法的优点是简便、直观，存在的弊端是：1. 根结线虫种类多，许多种类的会阴花纹特点比较容易混淆，使得鉴定的准确性完全依靠操作者的经验，误判的概率较高；2. 同一种类的根结线虫的会阴花纹存在个体差异，在实际操作时至少需要对20头以上的雌成虫进行观察才能确诊，费工、费时；3. 形态学鉴定只适用于成虫，不适宜幼虫，而土壤中分离到的根结线虫都是以二龄幼虫的形式存在，使的该方法在实际应用中受到限制。另外，同工酶电泳方法也是根结线虫鉴定中常用的方法，该方法以根结线虫雌成虫的蛋白粗提物进行聚丙烯酰胺电泳，通过酯酶和苹果酸脱氢酶同工酶染色后根据酶带的谱型来进行种类判断，该方法部分克服了形态学鉴定的缺点，可以比较快速准确的判断根结线虫种类，但依然只能用雌成虫来作为鉴定对象。