[发明专利]一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法

摘要

本发明公开一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，包括以下步骤：ERα蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔及脾脏总RNA提取；RT‑PCR扩增VH和VL片段及scFv基因拼接；构建PCANTAB5E‑ScFv重组质粒，重组质粒电转化E.coli TG1感受态细胞构建噬菌体单链抗体库；ERα阳性的乳腺癌组织切片和ERα蛋白作为固相化抗原对抗体库进行亲和富集筛选；采用Phage‑ElLSA法和乳腺癌细胞涂片免疫化学相结合的方法鉴定阳性克隆子。本发明建立了一种利用ERα阳性乳腺癌组织切片对噬菌体抗体库进行雌激素受体特异性筛选的方法，并利用phage‑ElLSA法和乳腺癌细胞涂片免疫化学相结合的方法来鉴定阳性克隆子，为噬菌体抗体库的筛选方法提供了新的思路。

主权项

1.一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，其特征在于：其包括以下步骤：（1）采用ERα蛋白作为免疫原免疫实验动物，三次免疫结束后耳缘静脉取血，采用ELISA法检测血清效价，效价达到要求后加强免疫三天后，处死实验动物，无菌条件下提取脾脏总RNA，逆转录合成cDNA；（2）设计简并引物扩增重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL，采用SOE‑PCR拼接VH和VL为scFv基因；（3）对PCANTAB5E噬菌体质粒和scFv基因分别进行双酶切处理，酶连构建PCANTAB‑ScFv重组质粒，重组质粒电转化E.coli TG1感受态细胞构建初级噬菌体单链抗体库，转化液梯度稀释并涂布2×YT‑A平板计算库容，挑取单克隆菌液PCR计算重组率；（4）初级噬菌体单链抗体库与ERα阳性的乳腺癌组织切片一同孵育，进行三轮富集筛选，富集得到的三级噬菌体单链抗体库与结合在固相载体上的ERα蛋白再进行两轮富集筛选，得到亲和力高、特异性强的特异性噬菌体单链抗体库；（5）特异性噬菌体单链抗体库侵染E.coli TG1，梯度稀释涂布2×YT‑A，挑取单克隆制备噬菌体上清，采用phage‑ElLSA法进行初步鉴定，选取OD450较高的单克隆再次制备噬菌体上清，与固定在载玻片上的乳腺癌细胞T47D一同孵育，细胞免疫化学鉴定阳性克隆子。