[发明专利]一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法

说明书

本发明公开一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，包括以下步骤：ERα蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔及脾脏总RNA提取；RT‑PCR扩增VH和VL片段及scFv基因拼接；构建PCANTAB5E‑ScFv重组质粒，重组质粒电转化E.coli TG1感受态细胞构建噬菌体单链抗体库；ERα阳性的乳腺癌组织切片和ERα蛋白作为固相化抗原对抗体库进行亲和富集筛选；采用Phage‑ElLSA法和乳腺癌细胞涂片免疫化学相结合的方法鉴定阳性克隆子。本发明建立了一种利用ERα阳性乳腺癌组织切片对噬菌体抗体库进行雌激素受体特异性筛选的方法，并利用phage‑ElLSA法和乳腺癌细胞涂片免疫化学相结合的方法来鉴定阳性克隆子，为噬菌体抗体库的筛选方法提供了新的思路。

技术领域

本发明属于噬菌体抗体库筛选方法技术领域，具体涉及一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法。

背景技术

雌激素受体(estrogen receptor,ER)作为一种生物标志物，它既是属核激素受体(nuclear receptor,NR)蛋白的一种，又是属于具有激活功能的转录因子，目前发现的ER具有ERα、ERβ、ERγ三种亚型。近年来，研究者发现雌激素受体α(ERα)在大约70％的乳腺癌病例中都表现出高表达和高活性水平。ERa的表达与乳腺癌密切相关，特别是肿瘤的发展。例如，乳腺癌治疗中降低ERα表达往往会有更好的治疗效果。ER表达水平与内分泌治疗的疗效密切相关，ER检测有助于预测患者对内分泌治疗的反应，其检测结果将直接决定治疗方案的选择。准确检测和报告ER状态对乳腺癌的临床治疗和预后判断非常重要，已成为乳腺癌病理诊断报告中必不可少的内容。免疫组织化学是目前ER检测的最佳方法。

美国博士Smithm在1985年第一次将外源蛋白的抗原基因序列通过基因工程技术组装在噬菌体内部，随着噬菌体侵染宿主菌完成自我组装，噬菌体的外壳表面展示出了蛋白抗原决定簇(与噬菌体次要外壳蛋白PIII融合表达)，同时提出了噬菌体展示技术的概念。现如今噬菌体展示技术已经成为了筛选目的蛋白和目的基因强有力的工具，是一种继多克隆技术，单克隆技术之后更为重要的基因工程技术。该技术目前广泛应用于筛选多肽和蛋白质、抗体等物质，具有简便、高效、低成本等优点，该技术可以从广泛和随机的文库中筛选出与靶标蛋白结合高亲和力、高特异性的抗体。

噬菌体抗体库的淘筛过程是文库的关键步骤，经典的抗原筛选方法即固相筛选，即将纯化抗原包被在如酶标板、亲和层析柱等固相介质上筛选一株特异性噬菌体，该方法是将非特异性的噬菌体进行洗脱，特异性的重组噬菌体进行富集的过程。但有时候由于位点封闭不完全，会出现非特异性噬菌体结合的情况且筛选出的阳性克隆未能在免疫组化结果上显现出较好的结合能力。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α(ERα)单链抗体的方法

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，包括以下步骤：

(1)采用雌激素受体α(ERα)蛋白作为免疫原免疫实验动物新西兰大白兔，三次免疫结束后耳缘静脉取血，采用ELISA法检测血清效价，效价达到要求后加强免疫三天后，处死实验动物，无菌条件下提取脾脏总RNA，逆转录合成cDNA；

(2)设计简并引物扩增重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)，采用SOE-PCR拼接VH和VL为scFv基因；

(3)对PCANTAB5E噬菌体质粒和scFv基因分别进行双酶切处理，酶连构建PCANTAB-ScFv重组质粒，重组质粒电转化E.coli TG1感受态细胞构建初级噬菌体单链抗体库，转化液梯度稀释并涂布2×YT-A平板计算库容，挑取单克隆菌液PCR计算重组率；