[发明专利]一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法

权利要求书

1.一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，其特征在于：其包括以下步骤：

（1）采用ERα蛋白作为免疫原免疫实验动物，三次免疫结束后耳缘静脉取血，采用ELISA法检测血清效价，效价达到要求后加强免疫三天后，处死实验动物，无菌条件下提取脾脏总RNA，逆转录合成cDNA；

（2）设计简并引物扩增重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL，采用SOE-PCR拼接VH和VL为scFv基因；

（3）对PCANTAB5E噬菌体质粒和scFv基因分别进行双酶切处理，酶连构建PCANTAB-ScFv重组质粒，重组质粒电转化E.coli TG1感受态细胞构建初级噬菌体单链抗体库，转化液梯度稀释并涂布2×YT-A平板计算库容，挑取单克隆菌液PCR计算重组率；

（4）初级噬菌体单链抗体库与ERα阳性的乳腺癌组织切片一同孵育，进行三轮富集筛选，富集得到的三级噬菌体单链抗体库与结合在固相载体上的ERα蛋白再进行两轮富集筛选，得到亲和力高、特异性强的特异性噬菌体单链抗体库；

（5）特异性噬菌体单链抗体库侵染E.coli TG1，梯度稀释涂布2×YT-A，挑取单克隆制备噬菌体上清，采用phage-ElLSA法进行初步鉴定，选取OD450较高的单克隆再次制备噬菌体上清，与固定在载玻片上的乳腺癌细胞T47D一同孵育，细胞免疫化学鉴定阳性克隆子。

2.根据权利要求1所述的一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述实验动物为新西兰大白兔。

3.根据权利要求1所述的一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述ERα蛋白预先经EDTA抗原热修复处理后再作为免疫原。

4.根据权利要求1所述的一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，其特征在于：步骤（2）中，共设计9对引物扩增VL基因，4对引物扩增VH基因，VL基因和VH基因中间添加一段多肽链Linker相连接，所述多肽链Linker氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。

5.根据权利要求1所述的一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述PCANTAB5E噬菌体质粒和scFv基因分别进行sfiI 和NotI双酶切处理，采用T4DNA电转专用连接酶连接构建PCANTAB-ScFv重组质粒，电转化大肠杆菌电转专用感受态细胞TG1，按照MOi=100:1加入滴度大于10¹²pfu/ml的辅助噬菌体M13KO7，构建初级噬菌体单链抗体库，初级噬菌体单链抗体库采用双层琼脂法计算噬菌体滴度，随机挑取单克隆菌液PCR计算重组率。

6.根据权利要求1所述的一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，其特征在于：步骤（4）中，初级噬菌体单链抗体库与ERα阳性的乳腺癌组织切片一同孵育，弃去未与组织片结合的噬菌体，将结合的噬菌体用Gly-HCL洗脱下来进行扩增，进行三轮富集筛选得到三级噬菌体单链抗体库；三级噬菌体单链抗体库与结合在酶标板上的ERα蛋白一同孵育，增加洗脱次数洗去未结合的噬菌体，最大限度的富集与ERα蛋白结合的噬菌体，进行两轮富集筛选，得到特异性噬菌体单链抗体库。

7.根据权利要求1所述的一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，其特征在于：步骤（5）中，特异性噬菌体单链抗体库侵染E.coli TG1，梯度稀释涂布2×YT-A，挑取30颗单克隆制备噬菌体上清作为一抗，HRP标记鼠抗M13KO7为二抗，，采用phage-ElLSA法进行初步鉴定，选取OD450较高的7株单克隆再次制备噬菌体上清，与固定在载玻片上乳腺癌细胞T47D一同孵育，HRP标记鼠抗M13KO7为二抗，经DAB染色，苏木素复染，PBS返蓝步骤后，观察细胞涂片鉴定阳性克隆子。