[发明专利]midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系的构建和鉴定方法

摘要

本发明公开了一种midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系的构建和鉴定方法，其特征在于：将编码midkine的DNA序列融合到表达载体pCDNA3.1，转染肿瘤细胞，通过geneticin筛选建立midkine高表达细胞系，使用Western Blot检测确认midkine蛋白表达水平提高；通过增殖曲线测定，发现高表达midkine细胞增殖速度明显加快；提取正常和低糖条件培养细胞的蛋白，进行Western Blot实验，证明高表达midkine的细胞中AMPK磷酸化激活收到抑制，符合midkine蛋白的功能特征。上述结果证明midkine高表达细胞系构建成功，并可以正调控细胞增殖，抑制AMPK通路活性。本方法的建立提供了midkine蛋白稳定高表达细胞系的构建和鉴定方法，研究midkine蛋白的功能，揭示其影响细胞增殖和AMPK通路的机制提供条件，为实现midkine的临床转化应用提供了新的思路。

主权项

1.midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系的构建和鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将midkine编码序列克隆到真核生物表达载体pCDNA3.1，得到midkine表达载体pCDNA‑MDK；(2)使用载体pCDNA‑MDK感染肿瘤细胞，并用geneticin进行筛选，获得稳定高表达midkine蛋白的肿瘤细胞系；(3)使用Western Blot方法检测midkine蛋白水平验证midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系构建成功；(4)使用增殖曲线测定方法验证midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系构建成功；(5)使用AMPK活性检测的方法验证midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系构建成功。