[发明专利]midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系的构建和鉴定方法

权利要求书

1.midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系的构建和鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将midkine编码序列克隆到真核生物表达载体pCDNA3.1，得到midkine表达载体pCDNA-MDK；

（2）使用载体pCDNA-MDK感染肿瘤细胞，并用geneticin进行筛选，获得稳定高表达midkine蛋白的肿瘤细胞系；

（3）使用Western Blot方法检测midkine蛋白水平验证midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系构建成功；

（4） 使用增殖曲线测定方法验证midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系构建成功；

（5） 使用AMPK活性检测的方法验证midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系构建成功；

所述步骤（1）中midkine真核表达载体pCDNA-MDK的构建方法，包含以下步骤：

1）以人cDNA为模板，使用下列带有接头序列的引物

F：5'- TCGAGGATCCATGCAGCACCGAGGC - 3'

R：5'- TGCACTCGAGCTACTAGTCCTTTCCCTTCCC - 3'；

进行PCR反应扩增midkine编码基因序列；

2）对步骤1）获得的PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收相应片段；

3）使用限制性内切酶BamHI和XhoI同时对PCR产物和pCDNA3.1载体进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切样品，回收目的条带；

4）使用T4 DNA连接酶，将midkine基因片段连接到线性化的pCDNA3.1载体；

5）转化大肠杆菌Stbl3，挑选单菌落进行培养，提取质粒并酶切鉴定，将正确的质粒进行测序，确定midkine序列完全正确，获得载体pCDNA-MDK；

所述步骤（5）中通过检测AMPK通路活性对midkine稳定高表达肿瘤细胞系进行鉴定的方法，包含以下步骤：

1）分别培养上述midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系和敲低表达及相应对照肿瘤细胞系， 达到足够数量后，按0.5-1.5X10⁶细胞/皿的数量接种到6 cm培养皿中；

2）待12-24小时细胞贴壁后，在gibco公司货号为 C11995500BT 的DMEM培养基中加入终浓度10-50mM的2-DG，或将gibco公司货号为11966-025的 DMEM培养基由正常葡萄糖25mM糖浓度更换为无糖或1-2.5 mM低糖，继续培养1-24小时；

3）吸走培养基，加入1-2 ml Hyclone公司货号为SH30256.01的PBS洗去剩余培养基，吸走PBS，将细胞培养皿置于液氮中淬灭；

4） 每个培养皿加入100-200 μl的CST公司货号为9806S 的RIPA裂解液，破碎细胞，提取蛋白；

5）进行Western Blot实验，利用β-actin，AMPKα，midkine，p-AMPKα T72，p70S6K，p-p70S6K T389，ACC，p-ACC S79特异抗体，检测到与对照组相比，在进行2-DG处理，或低糖处理之后，在内参β-actin以及AMPK总量不变的情况下，midkine高表达细胞系中，AMPK磷酸化受到抑制，而AMPK直接底物ACC磷酸化水平上调，而其负调控的p70S6K磷酸化水平上调，与midkine具有抑制AMPK活性的功能相符，进一步证明midkine蛋白高表达细胞系构建成功。

2.根据权利要求1所述的构建和鉴定方法，其特征在于，所述步骤（2）中midkine稳定高表达肿瘤细胞系的构建方法，包含以下步骤：

（1）使用pCDNA-MDK转染肿瘤细胞；

（2）转染后48-72小时后开始使用终浓度0.2-1mg/ml的geneticin进行连续筛选；

（3）筛选2-3周后，待细胞不再在geneticin作用下死亡，停止筛选，得到待鉴定的midkine蛋白高表达肿瘤细胞系。