[发明专利]midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系的构建和鉴定方法

说明书

本发明公开了一种midkine蛋白稳定高表达肿瘤细胞系的构建和鉴定方法，其特征在于：将编码midkine的DNA序列融合到表达载体pCDNA3.1，转染肿瘤细胞，通过geneticin筛选建立midkine高表达细胞系，使用Western Blot检测确认midkine蛋白表达水平提高；通过增殖曲线测定，发现高表达midkine细胞增殖速度明显加快；提取正常和低糖条件培养细胞的蛋白，进行Western Blot实验，证明高表达midkine的细胞中AMPK磷酸化激活收到抑制，符合midkine蛋白的功能特征。上述结果证明midkine高表达细胞系构建成功，并可以正调控细胞增殖，抑制AMPK通路活性。本方法的建立提供了midkine蛋白稳定高表达细胞系的构建和鉴定方法，研究midkine蛋白的功能，揭示其影响细胞增殖和AMPK通路的机制提供条件，为实现midkine的临床转化应用提供了新的思路。

技术领域

本发明属于细胞生物学和转化医学领域，尤其涉及一种midkine蛋白稳定高表达细胞系的构建和鉴定方法。

背景技术

人类midkine蛋白分子量约为13kD，是一种肝素(heparin)结合蛋白，属于多效生长因子(pleiotrophin)家族。研究显示，midkine在人体组织中广泛表达，并参与免疫炎症反应，神经发育，血压调控等多种生理过程的调控，并具有促进细胞增殖和迁移的功能。临床样本数据显示，在乳腺癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌等多种恶性肿瘤中，midkine的表达水平呈现上调趋势，且高表达midkine的病人组生存率显著下调，证明midkine是一种促癌因子。

作为一种生长因子，通过受体-配体相互结合激活下游通路是midkine的重要作用方式，已经发现的细胞膜midkine受体包括ALK(anaplastic lymphoma kinase)，PTPζ(protein tyrosine phosphataseζ),Notch2，低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受体LRP1(LDL receptor protein 1)等。然而，以上所述受体均非midkine的特异受体，且无证据显示midkine影响肿瘤的发生发展是通过上述受体完成的。

AMPK(AMP-activated protein kinase)蛋白是真核生物特有的能量感受和调节因子，在细胞的代谢平衡调控中处于核心地位。AMPK是由α，β，γ三个亚基组成的异三聚体，其中β和γ亚基为调节亚基，γ亚基结合AMP(5’-adenosine monophosphate)使催化亚基α发生变构，被上游激酶LKB1(liver kinase 1)激活。当能量胁迫发生，细胞中AMP/ATP (5'-Adenylate triphosphate)比例发生变化时，AMPK大量磷酸化激活，进而发挥激酶活性通过磷酸化激活或抑制众多不同的下游底物，调控糖酵解，脂肪酸合成和β氧化，氨基酸代谢，糖原合成，细胞自噬等众多通路，达到促进分解代谢，抑制合成代谢，终止耗能生理过程的目的，使细胞适应能量胁迫的环境。如果在能量胁迫环境中AMPK不能很好地激活，细胞会由于能量缺乏受损，发生细胞凋亡。

细胞增殖是一项耗能的生理过程，不仅需要进行核酸合成完成染色体复制，还需要合成大量脂类及蛋白等生物大分子组成新细胞的结构物质。因此，AMPK激活后，会抑制细胞增殖的过程。AMPK抑制细胞增殖的功能主要通过抑制复合体mTORC1(mechanistictarget of rapamycin complex 1)完成。AMPK激活后，一方面可以磷酸化激活mTORC1复合体的抑制因子TSC1/2(Tuberous Sclerosis complex 1/2)，另一方面可以磷酸化抑制mTORC1的激活因子 Raptor(regulatory-associated protein of mTOR)，从而抑制mTORC1的活性，阻止其下游介导的转录起始，蛋白合成过程，抑制细胞增殖。