[发明专利]一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量PCR方法

摘要

本发明公开了一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量PCR方法。本发明采用了特异性引物和探针技术，可以实现血液样本基因点突变的快速检测。本发明的优势包括：(1)在常规ARMS引物的基础上增加了LNA修饰或者在3’末二位‑末三位额外引入错配碱基，既不影响突变检测灵敏度，又保证了突变特异性引物检测单碱基突变的特异性；(2)引入与野生型完全互补的修饰阻滞探针，兼顾突变型扩增效率的基础上进一步降低野生型背景干扰；(3)在引入高特异性修饰阻滞探针的基础上，ARMS引物可以同时检测同一个位点的不同碱基突变形式，从而实现同一个基因多个位点只用几个体系实现兼并检测；(4)灵敏度高；(5)检测速度快。

主权项

1.一种用于检测核酸中的特异位点的引物探针组合，为如下(a1)或(a2)：(a1)由通用上游引物、通用下游引物、通检探针、特异扩增上游引物和阻滞探针组成；所述通用上游引物为通用上游引物-Ⅰ或通用上游引物-Ⅱ；所述通用下游引物为通用下游引物-Ⅰ或通用下游引物-Ⅱ；所述通用上游引物-Ⅰ和所述通用下游引物-Ⅰ的组合用于扩增靶序列；所述靶序列为所述核酸中的片段且含有所述特异位点；所述通用上游引物-Ⅰ和所述通用下游引物-Ⅰ中不含有所述特异位点；所述通用上游引物-Ⅱ为将通用上游引物-Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与通用上游引物-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述通用下游引物-Ⅱ为将通用下游引物-Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与通用下游引物-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述通检探针为反向通检探针或正向通检探针；所述反向通检探针为反向通检探针-Ⅰ或反向通检探针-Ⅱ；所述反向通检探针-Ⅰ与所述靶序列中所述特异位点以外的某一区段反向互补；所述反向通检探针-Ⅱ为将反向通检探针-Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与反向通检探针-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述正向通检探针为正向通检探针-Ⅰ或正向通检探针-Ⅱ；所述正向通检探针-Ⅰ与所述靶序列中所述特异位点以外的某一区段相同；所述正向通检探针-Ⅱ为将正向通检探针-Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与正向通检探针-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述通检探针的两个末端分别采用荧光基团和淬灭基团修饰；所述特异扩增上游引物为特异扩增上游引物-Ⅰ或特异扩增上游引物-Ⅱ或特异扩增上游引物-Ⅲ；所述特异扩增上游引物-Ⅰ满足如下三个条件：与所述靶序列中的某一区段相同、3’末端核苷酸对应所述特异位点、3’末端核苷酸与突变后核苷酸相同；所述特异扩增上游引物-Ⅱ为将特异扩增引物-Ⅰ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与特异扩增上游引物-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述特异扩增上游引物-Ⅲ为将特异扩增上游引物-Ⅰ或特异扩增上游引物-Ⅱ中的1-5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针为阻滞探针-Ⅰ或阻滞探针-Ⅱ或阻滞探针-Ⅲ；所述阻滞探针-Ⅰ满足如下两个条件：与所述靶序列中的某一区段相同、某一个核苷酸对应所述特异位点且该核苷酸与突变前核苷酸相同；所述阻滞探针-Ⅱ为将阻滞探针-Ⅰ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与阻滞探针-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述阻滞探针-Ⅲ为将阻滞探针-Ⅰ或阻滞探针-Ⅱ中的1-5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针的3’末端进行阻断修饰；(a2)由通用上游引物、通用下游引物、通检探针、特异扩增下游引物和阻滞探针组成；所述通用上游引物和通用下游引物为(a1)中所述的通用上游引物；所述通检探针为(a1)中所述的通检探针；所述特异扩增下游引物为特异扩增下游引物-Ⅰ或特异扩增下游引物-Ⅱ或特异扩增下游引物-Ⅲ；所述特异扩增下游引物-Ⅰ满足如下三个条件：与所述靶序列中的某一区段反向互补、3’末端核苷酸对应所述特异位点、3’末端核苷酸与突变后核苷酸互补；所述特异扩增下游引物-Ⅱ为将特异扩增下游引物-Ⅰ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与特异扩增下游引物-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述特异扩增上游引物-Ⅲ为将特异扩增下游引物-Ⅰ或特异扩增下游引物-Ⅱ中的1-5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针为阻滞探针-Ⅳ或阻滞探针-Ⅴ或阻滞探针-Ⅵ；所述阻滞探针-Ⅳ满足如下两个条件：与所述靶序列中的某一区段反向互补、某一个核苷酸对应所述特异位点且该核苷酸与突变前核苷酸互补；所述阻滞探针-Ⅴ为将阻滞探针-Ⅳ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与阻滞探针-Ⅳ具有相同功能的DNA分子；所述阻滞探针-Ⅵ为将阻滞探针-Ⅳ或阻滞探针-Ⅴ中的1-5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针的3’末端进行阻断修饰；所述特异位点为核酸中发生目标点突变的位点；所述特异位点上，未发生目标点突变的核苷酸命名为突变前核苷酸，发生目标点突变的核苷酸命名为突变后核苷酸。