[发明专利]一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量PCR方法

权利要求书

1.一种用于检测核酸中是否存在EGFR基因T790M突变的引物探针组合，由通用上游引物、通用下游引物、通检探针、特异扩增下游引物和阻滞探针组成；所述通用上游引物为序列表的序列1所示的单链DNA分子；所述通用下游引物为序列表的序列2所示的单链DNA分子；所述特异扩增下游引物为序列表的序列3所示的单链DNA分子，其中从5’端第5位核苷酸、第6位核苷酸和第7位核苷酸进行LNA修饰；所述通检探针为序列表的序列4所示的单链DNA分子，5’端采用FAM荧光基团标记，3’端采用BHQ1淬灭基团标记；所述阻滞探针为序列表的序列5所示的单链DNA分子，其中从5’端第5位核苷酸、第6位核苷酸和第7位核苷酸进行LNA修饰，3’端进行氨基修饰。

2.一种用于检测核酸中是否存在K-ras基因突变的引物探针组合，由通用上游引物、通用下游引物、通检探针、特异扩增上游引物和阻滞探针组成；

所述通用上游引物如序列表的序列8所示；

所述通用下游引物如序列表的序列9所示；

所述特异扩增上游引物为如下（b1）和/或（b2）和/或（b3）：

（b1）序列表的序列10所示的单链DNA分子；

（b2）序列表的序列11所示的单链DNA分子；

（b3）序列表的序列12所示的单链DNA分子；

所述通检探针如序列表的序列13所示，其中从5’端第7位核苷酸、第8位核苷酸、第11位核苷酸、第12位核苷酸和第14位核苷酸进行LNA修饰；

所述阻滞探针如序列表的序列14所示，其中从5’端第7位核苷酸、第9位核苷酸和第10位核苷酸进行LNA修饰，3’端进行氨基修饰。

3.一种检测核酸中是否存在EGFR基因T790M突变的方法，包括如下步骤：（1）以待测核酸为模板，采用权利要求1中所述的通用上游引物、通用下游引物、通检探针进行荧光定量PCR；（2）以待测核酸为模板，采用权利要求1中所述的特异扩增下游引物、通用上游引物、通检探针和阻滞探针进行荧光定量PCR；（3）如果步骤（1）的荧光定量PCR可以得到阳性扩增并且步骤（2）的荧光定量PCR不能得到阳性扩增或ct值大于等于37、待测核酸中不存在EGFR基因T790M突变，如果步骤（1）的荧光定量PCR可以得到阳性扩增并且步骤（2）的荧光定量PCR可以得到阳性扩增且ct值小于37、待测核酸中存在EGFR基因T790M突变；

所述方法为非疾病诊断和治疗的方法。

4.检测核酸中是否存在K-ras基因2号外显子突变的方法，为方法甲或方法乙或方法丙；

所述方法甲包括如下步骤：（1）以待测核酸为模板，采用权利要求2中所述的通用上游引物、通用下游引物、通检探针进行荧光定量PCR；（2）以待测核酸为模板，采用权利要求2中所述的特异扩增上游引物（b1）、通用下游引物、通检探针和阻滞探针进行荧光定量PCR；（3）如果步骤（1）的荧光定量PCR可以得到阳性扩增并且步骤（2）的荧光定量PCR不能得到阳性扩增或ct值大于等于37、待测核酸中不存在K-ras基因2号外显子G12A突变且不存在K-ras基因2号外显子G12V突变且不存在K-ras基因2号外显子G12D突变，如果步骤（1）的荧光定量PCR可以得到阳性扩增并且步骤（2）的荧光定量PCR可以得到阳性扩增且ct值小于37、待测核酸中存在K-ras基因2号外显子G12A突变或K-ras基因2号外显子G12V突变或K-ras基因2号外显子G12D突变；

方法乙包括如下步骤：（1）以待测核酸为模板，采用权利要求2中所述的通用上游引物、通用下游引物、通检探针进行荧光定量PCR；（2）以待测核酸为模板，采用权利要求2中所述的特异扩增上游引物（b2）、通用下游引物、通检探针和阻滞探针进行荧光定量PCR；（3）如果步骤（1）的荧光定量PCR可以得到阳性扩增并且步骤（2）的荧光定量PCR不能得到阳性扩增或ct值大于等于37、待测核酸中不存在K-ras基因2号外显子G12S突变且不存在K-ras基因2号外显子G12C突变且不存在K-ras基因2号外显子G12R突变，如果步骤（1）的荧光定量PCR可以得到阳性扩增并且步骤（2）的荧光定量PCR可以得到阳性扩增且ct值小于37、待测核酸中存在K-ras基因2号外显子G12S突变或K-ras基因2号外显子G12C突变或K-ras基因2号外显子G12R突变；

方法丙包括如下步骤：（1）以待测核酸为模板，采用权利要求2中所述的通用上游引物、通用下游引物、通检探针进行荧光定量PCR；（2）以待测核酸为模板，采用权利要求2中所述的特异扩增上游引物（b3）、通用下游引物、通检探针和阻滞探针进行荧光定量PCR；（3）如果步骤（1）的荧光定量PCR可以得到阳性扩增并且步骤（2）的荧光定量PCR不能得到阳性扩增或ct值大于等于37、待测核酸中不存在K-ras基因2号外显子G13D突变，如果步骤（1）的荧光定量PCR可以得到阳性扩增并且步骤（2）的荧光定量PCR可以得到阳性扩增且ct值小于37、待测核酸中存在K-ras基因2号外显子G13D突变；

所述方法为非疾病诊断和治疗的方法。