[发明专利]一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量PCR方法

说明书

本发明公开了一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量PCR方法。本发明采用了特异性引物和探针技术，可以实现血液样本基因点突变的快速检测。本发明的优势包括：(1)在常规ARMS引物的基础上增加了LNA修饰或者在3’末二位‑末三位额外引入错配碱基，既不影响突变检测灵敏度，又保证了突变特异性引物检测单碱基突变的特异性；(2)引入与野生型完全互补的修饰阻滞探针，兼顾突变型扩增效率的基础上进一步降低野生型背景干扰；(3)在引入高特异性修饰阻滞探针的基础上，ARMS引物可以同时检测同一个位点的不同碱基突变形式，从而实现同一个基因多个位点只用几个体系实现兼并检测；(4)灵敏度高；(5)检测速度快。

技术领域

本发明涉及临床诊断分子生物学领域，具体涉及一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量PCR方法。

背景技术

随着人们对肿瘤发生过程的不断深入，目前认为癌症发生和基因突变有关，导致肿瘤细胞失控性增殖，因此可以根据基因突变情况来进行肿瘤筛查，再进行肿瘤易感基因检测，如果发现明确的异常，可以起到有针对性的提示作用。化疗是目前临床上治疗恶性肿瘤的最重要手段之一，但是，随着其在临床上的广泛运用，耐药问题日益突出，肿瘤细胞常常会对化疗药物产生耐药而导致患者对治疗不再敏感，最终导致化疗失败甚至疾病复发，其中EGFR基因T790M突变占临床耐药NSCLC患者的60％以上，而K-ras基因状态与结直肠癌(CRC)治疗密切相关，携带野生型K-ras基因的mCRC患者从EGFR抑制剂的治疗中获益更大，而K-ras基因突变的mCRC患者无法从EGFR抑制剂联合化疗方案中获益。

传统肿瘤检测样本获取，一般需要通过手术或穿刺原位，对病人产生创伤、无法进行动态监测等局限性，而新型“液体活检”从血浆为代表的体液样本获得游离核酸或细胞，进而应用于肿瘤早期诊断、靶向药物的选择以及动态疗效监测等，但由于肿瘤细胞或核酸在外周血中的含量相当低，因此血浆分子检测对检测技术的灵敏度要求较之组织更高。

目前基因突变检测的方法很多，包括如DNA直接测序、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、变性高效液相色谱法(HDPLC)、高分辨率溶解曲线技术(HRM)、限制小片段长度多态性分析法(RFLP)、ARMS-PCR等。其中DNA直接测序为突变检测的金标准，但该方法存在以下缺点：检测的敏感性不够高，如果突变基因的含量占基因组DNA总量的10％以下时，则用直接测序法检测不到突变样本的存在；且操作过程复杂，检测时间较长，对操作人员要求高；非闭管操作，涉及到PCR扩增后的操作，因此易被污染，假阴性率较高，造成结果的不理想；测序结果的判读主观性强；一次实验检测的样本量有限，最多只能8-24例。因此直接测序法难以在临床普遍开展。ARMS-PCR方法能够达到1％的灵敏度，对于肿瘤组织样本能够满足检测需求，但是对于取样方便的血液样本，如血浆或者血液中的循环肿瘤细胞，肿瘤DNA含量往往低于1％，ARMS-PCR方法不足以对血液进行检测，局限了临床医生对靶向药物疗效的判断。此外，在临床用药过程中产生的耐药性突变，以前的方法由于灵敏度不够也无法进行检测。因此，从这些低含量样本中检测突变的基因，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量PCR方法。

本发明提供了一种用于检测核酸中的特异位点的引物探针组合，为如下(a1)或(a2)：

(a1)由通用上游引物、通用下游引物、通检探针、特异扩增上游引物和阻滞探针组成；