[发明专利]一种快速检测氯霉素残留的方法

摘要

一种快速检测氯霉素残留的方法，属于检验技术领域。本发明采用活性酯法将含有羧基的半抗原琥珀氯霉素与载体蛋白质直接偶联制备免疫原和包被抗原，以经前述包被抗原表面修饰的多模光纤探头检测对实际样品进行检测，由于氯霉素抗体结合到传感器上的差异，导致可见光在传感器膜面上形成的干涉光谱位移差异，通过检测这种位移变化间接反映目标物氯霉素抗体的浓度，由此实现对氯霉素的检测。该检测方法较传统仪器分析方法更为简单快捷，且检测成本较低，有望进行大规模的推广应用。

主权项

一种快速检测氯霉素残留的方法，其特征在于：包括下列步骤：第一步：制备氯霉素半琥珀酸酯将氯霉素、琥珀酸酐、丙酮及吡啶混合，搅拌使可溶物溶解，回流反应后得到的反应液经浓缩，得淡黄色粘稠液体，用乙酸乙酯洗出，然后加1M的HCl分层，取有机相，再用质量分数为10%的 NaHCO3转溶后，用浓盐酸将pH值调至2，用乙酸乙酯萃取，取有机相，经浓缩后即得氯霉素半琥珀酸酯；第二步：制备包被原将氯霉素半琥珀酸酯溶于二甲基甲酰胺中，2~5℃条件下预冷10min后加入三丁胺混匀，接着加入氯甲酸异丁酯，3~5℃条件下搅拌18~22min，然后加入到牛血清蛋白溶液中，3~5℃条件下搅拌反应3~5h，反应产物用0.05 M 的pH值为7.4的PBS缓冲液透析，获得氯霉素‑BSA偶联物受体；所述牛血清蛋白溶液的制备方法为：将牛血清蛋白溶于二甲基甲酰胺中，2~5℃条件下预冷，再将pH值调至8，即得牛血清蛋白溶液；以氯霉素计算，氯霉素与牛血清蛋白的摩尔比为45~55：1；第三步：制备免疫原将卵清蛋白和氯霉素溶在5 mL冰冷的0.05M的硼砂缓冲液中，4℃搅拌，将上述1.5 mL A溶液逐滴加入到该溶液中，避光反应1 h，得到氯霉素包被抗原溶液，用pH值为7.4的PBS缓冲液透析5d，每12 h更换一次透析液，将透析后的溶液离心300015 min，弃沉淀，冻干上清液，获得免疫原；第四步：光纤传感器抗原包被修饰将APS光纤传感器末端没入包被原溶液中，室温静置5 min；再将APS光纤生物传感器末端没入质量分数为15%的蔗糖水溶液中，室温静置1 min，然后室温晾干后置于2～8℃干燥条件下保存，备用；第五步：金标氯霉素包被原制备向1 ml胶体金中加入1μL的0.5mg/ml的氯霉素‑BSA偶联物受体，涡旋混匀，室温静置15 min，加入100 μL 的质量分数为10%的牛血清白蛋白溶液，室温封闭15 min，10000 rpm离心10 min，弃掉上层清液，加入90 μL pH值为 7.4 的PB缓冲液，重悬颗粒，得到金标BSA；第五步：检测将氯霉素‑BSA偶联物用pH值为7.4的PB缓冲液稀释20倍，取200μL于微孔板的第2列；用巴氏杀菌奶稀释氯霉素标准品到0.1、0.05、0.025和0.0125 ng/ml，分别取200 μL于微孔板的第4列，并加入5μL金标氯霉素抗体、50μL反应液，混匀；往微孔板第1列中加入200 μL水，往微孔板的第3列加入200μL巴氏杀菌奶、5μL金标BSA、50μL反应液，混匀；用APS光纤传感器进行检测：第一列60 s，第2列60 s；第3列60 s；第4列400 s。