[发明专利]一种快速检测氯霉素残留的方法

权利要求书

1.一种快速检测氯霉素残留的方法，其特征在于：包括下列步骤：

第一步：制备氯霉素半琥珀酸酯

将氯霉素、琥珀酸酐、丙酮及吡啶混合，搅拌使可溶物溶解，回流反应后得到的反应液经浓缩，得淡黄色粘稠液体，用乙酸乙酯洗出，然后加1M的HCl分层，取有机相，再用质量分数为10%的 NaHCO₃转溶后，用浓盐酸将pH值调至2，用乙酸乙酯萃取，取有机相，经浓缩后即得氯霉素半琥珀酸酯；

第二步：制备包被原

将氯霉素半琥珀酸酯溶于二甲基甲酰胺中，2~5℃条件下预冷10min后加入三丁胺混匀，接着加入氯甲酸异丁酯，3~5℃条件下搅拌18~22min，然后加入到牛血清蛋白溶液中，3~5℃条件下搅拌反应3~5h，反应产物用0.05 M 的pH值为7.4的PBS缓冲液透析，获得氯霉素-BSA偶联物受体；所述牛血清蛋白溶液的制备方法为：将牛血清蛋白溶于二甲基甲酰胺中，2~5℃条件下预冷，再将pH值调至8，即得牛血清蛋白溶液；以氯霉素计算，氯霉素与牛血清蛋白的摩尔比为45~55：1；

第三步：制备免疫原

将卵清蛋白和氯霉素溶在5 mL冰冷的0.05M的硼砂缓冲液中，4℃搅拌，将上述1.5 mL A溶液逐滴加入到该溶液中，避光反应1 h，得到氯霉素包被抗原溶液，用pH值为7.4的PBS缓冲液透析5d，每12 h更换一次透析液，将透析后的溶液离心300015 min，弃沉淀，冻干上清液，获得免疫原；

第四步：光纤传感器抗原包被修饰

将APS光纤传感器末端没入包被原溶液中，室温静置5 min；再将APS光纤生物传感器末端没入质量分数为15%的蔗糖水溶液中，室温静置1 min，然后室温晾干后置于2～8℃干燥条件下保存，备用；

第五步：金标氯霉素包被原制备

向1 ml胶体金中加入1μL的0.5mg/ml的氯霉素-BSA偶联物受体，涡旋混匀，室温静置15 min，加入100 μL 的质量分数为10%的牛血清白蛋白溶液，室温封闭15 min，10000 rpm离心10 min，弃掉上层清液，加入90 μL pH值为 7.4 的PB缓冲液，重悬颗粒，得到金标BSA；

第五步：检测

将氯霉素-BSA偶联物用pH值为7.4的PB缓冲液稀释20倍，取200μL于微孔板的第2列；用巴氏杀菌奶稀释氯霉素标准品到0.1、0.05、0.025和0.0125 ng/ml，分别取200 μL于微孔板的第4列，并加入5μL金标氯霉素抗体、50μL反应液，混匀；往微孔板第1列中加入200 μL水，往微孔板的第3列加入200μL巴氏杀菌奶、5μL金标BSA、50μL反应液，混匀；用APS光纤传感器进行检测：第一列60 s，第2列60 s；第3列60 s；第4列400 s。

2.根据权利要求1所述的快速检测氯霉素残留的方法，其特征在于：还包括APS光纤传感器的再生，包括：

平衡：将APS光纤传感器末端没入空白基质底液中120s，该空白基质底液含有200μL的底液、50 μL的反应液、5μL金标BSA；

检测：将APS光纤传感器末端没入氯霉素素检测阴性底液600s，该氯霉素素检测阴性底液含有200μL氯霉素素检测阴性样液、50μL反应液和5μL金标氯霉素素受体；

再生：将APS光纤生物传感器探头底部没入Gly/DMF30 s，该Gly/DMF由4倍体积的0.1 M甘氨酸溶液与1倍体积的二甲基甲酰胺混合混合后构成；

洗涤：用pH值为7.4的PBS缓冲液洗涤APS光纤生物传感器探头底部一次。

3.根据权利要求1或2所述的快速检测氯霉素残留的方法，其特征在于：所述反应液为pH 值为7.4的PBS缓冲液。

4.根据权利要求1所述的快速检测氯霉素残留的方法，其特征在于：所述底液为奶粉溶于水后制得，其质量分数为10%。