[发明专利]一种快速检测氯霉素残留的方法

说明书

技术领域

本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种快速检测氯霉素残留的方法，特别涉及一种基于光学传感器的氯霉素残留的快速检测方法。

背景技术

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一种广谱抗生素，由于其低廉的价格和稳定的抗菌性，曾在一段时间内作为饲料添加剂和兽医临床常用药品。但氯霉素有严重的毒副作用，能引起再生障碍性贫血症和婴儿灰色综合症。氯霉素在动物性食品中的残留是通过水产品、肉制品、奶、蛋等作用于人类，因而美国和欧共体已禁止在动物中使用氯霉素，并规定在动物源食品中不得检出。

氯霉素在水产品、畜产品中残留的检测方法，国内外报道很多，包括微生物法、色谱法、免疫测定法等，微生物法易操作、费用低，但灵敏度低、特异性差。色谱法精确可靠、灵敏度高，检测极限可达到0.1μg/kg，但前处理步骤多，回收率偏低。免疫测定具有灵敏度高、特异性强、对仪器设备和人员素质要求低以及样品前处理简单等优点，适于现场监控和大规模样品筛选。免疫学检测方法的灵敏度高及特异性较强，但相应抗体的研发时间长而成本高，且重复性及稳定性较差。

传感器方法是近些年发展起来的新型检测技术，基于生物学原理的传感器使以生物活性物质作为传感器的识别原件，与样品中的待测物质发生特异性反应，通过适当的换能器将这些反应（形成复合物、发色、发光等）转换成可以输出检测的信号（电压、频率等），通过分析信号对待测物进行定性和定量检测。随着光纤传感技术及各种生物固定技术的广泛研究，光纤生物传感器（fiber optic biosensor，FOBS）得到了迅速的发展，各类光纤生物传感器的研制开发成为生物传感器的发展热点。

光纤传感器是一类在物理或化学激励下产生光学特性变化，引起光纤中传播光束的特征参量，如强度、波长、相位、偏振态等的改变，并为与光纤相连接的各种检测器件所响应的装置。其中，生物膜干涉技术基于光吸收、荧光和光反射原理，通过蛋白分子结合到传感器上的差异，导致可见光在传感器膜面上形成的干涉光谱位移差异，通过检测这种位移变化间接反映蛋白分子的浓度。因此，开发基于生物膜干涉技术的氯霉素检测方法有助于快速检测动物源性食品中氯霉素残留。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速检测氯霉素残留的方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种快速检测氯霉素残留的方法，其特征在于：包括下列步骤：

第一步：制备氯霉素半琥珀酸酯

将氯霉素、琥珀酸酐、丙酮及吡啶混合，搅拌使可溶物溶解，回流反应后得到的反应液经浓缩，得淡黄色粘稠液体，用乙酸乙酯洗出，然后加1M的HCl分层，取有机相，再用质量分数为10%的 NaHCO₃转溶后，用浓盐酸将pH值调至2，用乙酸乙酯萃取，取有机相，经浓缩后即得氯霉素半琥珀酸酯；

第二步：制备包被原

将氯霉素半琥珀酸酯溶于二甲基甲酰胺中，2~5℃条件下预冷10min后加入三丁胺混匀，接着加入氯甲酸异丁酯，3~5℃条件下搅拌18~22min，然后加入到牛血清蛋白溶液中，3~5℃条件下搅拌反应3~5h，反应产物用0.05 M 的pH值为7.4的PBS缓冲液透析，获得氯霉素-BSA偶联物受体；所述牛血清蛋白溶液的制备方法为：将牛血清蛋白溶于二甲基甲酰胺中，2~5℃条件下预冷，再将pH值调至8，即得牛血清蛋白溶液；以氯霉素计算，氯霉素与牛血清蛋白的摩尔比为45~55：1；

第三步：制备免疫原

将卵清蛋白和氯霉素溶在5 mL冰冷的0.05M的硼砂缓冲液中，4℃搅拌，将上述1.5 mL A溶液逐滴加入到该溶液中，避光反应1 h，得到氯霉素包被抗原溶液，用pH值为7.4的PBS缓冲液透析5d，每12 h更换一次透析液，将透析后的溶液离心300015 min，弃沉淀，冻干上清液，获得免疫原；

第四步：光纤传感器抗原包被修饰

将APS光纤传感器末端没入包被原溶液中，室温静置5 min；再将APS光纤生物传感器末端没入质量分数为15%的蔗糖水溶液中，室温静置1 min，然后室温晾干后置于2～8℃干燥条件下保存，备用；

第五步：金标氯霉素包被原制备

向1 ml胶体金中加入1μL0.5mg/ml的氯霉素-BSA偶联物受体，涡旋混匀，室温静置15 min，加入100 μL 的质量分数为10%的牛血清蛋白溶液，室温封闭15 min，10000 rpm离心10 min，弃掉上层清液，加入90 μL pH 7.4 的PB缓冲液，重悬颗粒，得到金标BSA。

第五步：检测