[发明专利]一种抗菌蛋白的分离纯化方法

摘要

本发明公开了一种抗菌蛋白分离纯化的方法，解决了现有蛋白质的分离纯化方法无法获得B.amyloliquefaciensF1高纯度的抗菌蛋白、杂质蛋白多和抗菌蛋白收率低的问题，对其稳定性研究，为开发抗菌蛋白的应用前景奠定了基础。本发明通过超滤浓缩、硫酸铵沉淀的方法获得抗菌粗蛋白；离子交换对抗菌粗蛋白进行初步纯化；凝胶层析纯化后获得较纯的抗菌蛋白。本发明的B.amyloliquefaciensF1抗菌蛋白在100℃处理30min时抑菌活性保留率在80%以上；在pH为5.0‑9.0范围内其抑菌活性仍然在70%以上；对胰蛋白酶较为敏感；经紫外线照射与反复冻融后仍然具有良好的抑菌活性；一价金属离子对抗真菌蛋白的抑菌活性没有显著性影响，表现出较好的稳定性。

主权项

B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白按以下步骤进行分离纯化：(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备将B.amyloliquefaciens F1菌株按2‑6％的接种量接种于含5mL营养肉汤的试管中摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液，吸取B.amyloliquefaciens F1种子液，以2‑6％的接种量添加到装载量20‑40％发酵培养基的锥形瓶中，摇瓶发酵得B.amyloliquefaciens F1发酵液；(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的提取首先将步骤(1)所得B.amyloliquefaciens F1发酵液进行超滤浓缩，即得浓缩液，在超滤浓缩液中，缓慢加入硫酸铵，使其达到一定饱和度，静置过夜，之后离心，收集沉淀，用原液1/10‑1/20体积PBS缓冲液溶解沉淀，装入透析袋后采用浓度相同的缓冲液透析，并且每隔一段时间换一次透析液，即得抗菌蛋白粗品；(3)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化采用NGC层析系统进行初步纯化，透析后的抗菌粗蛋白通过微孔滤膜过滤后，上样于离子交换柱，用缓冲液平衡，洗脱液进行线性梯度洗脱；以洗脱体积为横坐标，以280nm吸收值为纵坐标得洗脱图谱，收集主要分离组分；收集离子交换分离后具有抑菌活性的蛋白溶液，手动上样于Sephadex G‑75凝胶过滤层析柱，进行洗脱，以洗脱体积为横坐标，以280nm吸收值为纵坐标得洗脱图谱，并收集具有抑菌活性的蛋白溶液，即得较纯的抗菌蛋白。