[发明专利]一种抗菌蛋白的分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种抗菌蛋白分离纯化的方法，解决了现有蛋白质的分离纯化方法无法获得B.amyloliquefaciensF1高纯度的抗菌蛋白、杂质蛋白多和抗菌蛋白收率低的问题，对其稳定性研究，为开发抗菌蛋白的应用前景奠定了基础。本发明通过超滤浓缩、硫酸铵沉淀的方法获得抗菌粗蛋白；离子交换对抗菌粗蛋白进行初步纯化；凝胶层析纯化后获得较纯的抗菌蛋白。本发明的B.amyloliquefaciensF1抗菌蛋白在100℃处理30min时抑菌活性保留率在80%以上；在pH为5.0‑9.0范围内其抑菌活性仍然在70%以上；对胰蛋白酶较为敏感；经紫外线照射与反复冻融后仍然具有良好的抑菌活性；一价金属离子对抗真菌蛋白的抑菌活性没有显著性影响，表现出较好的稳定性。

技术领域

本发明属于微生物及生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法。

背景技术

解淀粉芽孢杆菌是与枯草芽孢杆菌相似，可产芽孢、革兰阳性(G+)、具有 生防活性的益生细菌。解淀粉芽胞杆菌在生长过程中可以产生一系列抑制真菌和 细菌活性的代谢物，已证实的抑菌物质包括抑菌蛋白类、脂肽类抗生素、大环类 酯类、肽类、聚酮化合物等，在抑制病原菌、环境保护、动物生产等方面已显示出益生菌的用途。抗菌蛋白大多是具有热稳定性，一般能耐受121℃高温而不失活，酸碱范围广，对紫外线有耐受性等特点。

从微生物发酵液中分离抗菌蛋白，目前，关于分离、纯化抗菌物质的主要方 法包括大孔树脂法、酸碱沉淀法、硫酸铵沉淀法、色谱法等方法。虽然许多生防 微生物都能分泌抗菌蛋白，而且蛋白质的分离纯化方法也已经发展得较为完善， 但由于菌株不同，其抗菌蛋白的性质迥异，纯化方法也各有差异。

B.amyloliquefaciens F1属于芽孢杆菌属，其保藏号为CGMCC No.10942， 保藏日期为2015年6月1日，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。B.amyloliquefaciens F1已在中国发明专利申请“一株具有高真菌抑制活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用”(专利公开号为CN 102153618A，公开日为2015年10月21日)中公布。B.amyloliquefaciens F1可产生抗真菌蛋白，对多种真菌都有抑制作用，但采用现有蛋白质的分离纯化方法无法获得高纯度的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白，杂质蛋白多，而且抗菌蛋白收率低。

发明内容

本发明要解决现有蛋白质的分离纯化方法无法获得高纯度的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白、杂质蛋白多和抗菌蛋白收率低的问题，而提供的 一种解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下： B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，所述B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白按以下步骤进行分离纯化：

(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备

将B.amyloliquefaciens F1菌株按2-6％的接种量接种于含5mL营养肉汤的 试管中摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液，吸取B.amyloliquefaciens F1 种子液，以2-6％的接种量添加到装载量20-40％发酵培养基的锥形瓶中，摇瓶发 酵得B.amyloliquefaciens F1发酵液；

(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的提取

首先取1L上述B.amyloliquefaciens F1发酵液进行超滤浓缩，即得浓缩液。 在超滤浓缩液中，缓慢加入硫酸铵，使其达到一定饱和度，4℃静置过夜，之后 8000-10000r/min离心20-30min，收集沉淀。用原液1/10-1/20体积PBS缓冲液溶 解沉淀，装入透析袋后采用浓度相同的缓冲液透析，并且每隔一段时间换一次透析液，即得抗菌蛋白粗品；