[发明专利]一种抗菌蛋白的分离纯化方法

权利要求书

1.B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述

B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白按以下步骤进行分离纯化：

(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备

将B.amyloliquefaciens F1菌株按2-6％的接种量接种于含5mL营养肉汤的试管中摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液，吸取B.amyloliquefaciens F1种子液，以2-6％的接种量添加到装载量20-40％发酵培养基的锥形瓶中，摇瓶发酵得B.amyloliquefaciensF1发酵液；所述B.amyloliquefaciens F1现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.10942，保藏日期为2015年6月1日；

(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的提取

首先将步骤(1)所得B.amyloliquefaciens F1发酵液进行超滤浓缩，即得浓缩液，在超滤浓缩液中，缓慢加入硫酸铵，使其达到一定饱和度，静置过夜，之后离心，收集沉淀，用原液1/10-1/20体积PBS缓冲液溶解沉淀，装入透析袋后采用浓度相同的缓冲液透析，并且每隔一段时间换一次透析液，即得抗菌蛋白粗品；所述超滤浓缩所用的超滤膜截留分子量为3-30kDa，硫酸铵饱和度为40-60％；PBS浓度为10mmol/L，pH 8.0；透析袋孔径为3-30kDa；

(3)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化

采用NGC层析系统进行初步纯化，透析后的抗菌粗蛋白通过0.22μm微孔滤膜过滤后，上样于离子交换柱，用缓冲液平衡，洗脱液进行线性梯度洗脱；以洗脱体积为横坐标，以280nm吸收值为纵坐标得洗脱图谱，收集主要分离组分；收集离子交换分离后具有抑菌活性的蛋白溶液，手动上样于Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，进行洗脱，以洗脱体积为横坐标，以280nm吸收值为纵坐标得洗脱图谱，并收集具有抑菌活性的蛋白溶液，即得较纯的抗菌蛋白。

2.根据权利要求1所述的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述B.amyloliquefaciens F1种子液制备过程为30-37℃摇床振荡培养18-24h；所述摇瓶发酵条件为30-37℃发酵48-72h。

3.根据权利要求1所述的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述发酵培养基为：蛋白胨10.0g，牛肉浸出粉3.0g，NaCl 5.0g，2g柠檬酸铵，4g蔗糖，0.2g硝酸钾，1000mL水。

4.根据权利要求1所述的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于：在步骤(2)中，透析48-60h，每12-24h更换一次透析液。

5.根据权利要求1所述的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述离子交换层析的条件为：离子交换柱为HiTrapTMHP-Q或者HiTrapTMHP-SP；平衡缓冲液为10mmol/L、pH 5.0-10.0的PBS，洗脱液为10mmol/L、pH5.0-10.0的PBS，上样量为5.0-20mg/g填料。

6.根据权利要求1所述的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述凝胶过滤层的条件为：洗脱液为10mmol/L、pH 5.0-10.0的PBS，上样体积为柱体积的0.5％-5％。