[发明专利]油莎草pepc基因的克隆及表达载体的构建和应用

摘要

本发明公开油莎草pepc基因的克隆及表达载体的构建和应用，通过对设计特异引物、RACE PCR扩增获得全长为3399bp的pepc基因，进而首先设计合成pepc oligo DNA序列，其次构建出具有导向作用的sgRNA载体，最后通过双酶切将包含有启动子区域、pepc oligo DNA序列及sgRNA的片段切开，与含有Cas蛋白的pP1C.1进行连接，成功构建pepc基因的CRISPR/Cas9载体，此载体在对烟草叶片进行浸染后，使烟草含油率提高33.4%，为后续pepc基因载体转化产油植物，获得、培育含油率较高的转基因植株奠定了基础，对于新品种培育、生产推广具有重要作用。

主权项

油莎草pepc基因的克隆方法，其特征在于，具体采用以下技术步骤：(1)以地上茎叶生长至7～8个时的油莎草地上茎叶为材料，提取总RNA；(2)设计特异引物：GSP1(5’RACE)：5'‑GCTTGTTGAGTATGATGCCCT‑3'；GSP2(3’RACE)：5'‑CCCTTCATGGTGAGGATAAGA‑3'；(3)利用正向引物、反向引物进行RACE PCR扩增；第一步：扩增体系如下：样本基因组DNA2μl、10*UPM 1.5μl、5’或3’GSP(10μM)1.5μl、La‑Taq0.2μl、dNTP 2μl、Mg2+2μl、Buffer 2μl、ddH2O 13.8μl，总计25μl；扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃30s，56℃30s，72℃3min30s，经34个循环后，72℃延伸10min。第二步：扩增体系如下：第一步反应物2μl、10*UPM 1.5μl、5’或3’GSP(10μM)1.5μl、La‑Taq 0.2μl、dNTP 2μl、Mg2+2μl、Buffer2μl、ddH2O 13.8μl、总计25μl。