[发明专利]油莎草pepc基因的克隆及表达载体的构建和应用

权利要求书

1.油莎草pepc基因的克隆方法，其特征在于，具体采用以下技术步骤：

(1)以地上茎叶生长至7～8个时的油莎草地上茎叶为材料，提取总RNA；

(2)设计特异引物：

GSP1(5’RACE)：5'-GCTTGTTGAGTATGATGCCCT-3'；

GSP2(3’RACE)：5'-CCCTTCATGGTGAGGATAAGA-3'；

(3)利用正向引物、反向引物进行RACE PCR扩增；

第一步：

扩增体系如下：样本基因组DNA2μl、10*UPM 1.5μl、5’或3’GSP(10μM)1.5μl、La-Taq0.2μl、dNTP 2μl、Mg²⁺2μl、Buffer 2μl、ddH₂O 13.8μl，总计25μl；

扩增程序如下：

94℃预变性5min，94℃30s，56℃30s，72℃3min30s，经34个循环后，72℃延伸10min。

第二步：扩增体系如下：第一步反应物2μl、10*UPM 1.5μl、5’或3’GSP(10μM)1.5μl、La-Taq 0.2μl、dNTP 2μl、Mg²⁺2μl、Buffer2μl、ddH₂O 13.8μl、总计25μl。

2.如权利要求1所述的油莎草pepc基因的克隆方法，其特征在于，所述的第二步扩增体系的5’和3’RACE温度分别设置为54℃和58℃。

3.油莎草PEPCase蛋白，其特征在于，PEPCase蛋白氨基酸的数量为965个，理论分子量及等电点分别为110129.27Da和6.07，脂肪系数为90.77，分子式C₄₉₂₀H₇₇₉₇N₁₃₅₃O₁₄₄₆S₃₄；碱性氨基酸(Arg+Lys)为127，酸性氨基酸(Asp+Glu)为140；PEPCase蛋白的GRAVY值为-0.386，该蛋白为亲水性蛋白。PEPC羧化酶蛋白质不包含信号肽，推测油莎草PEPC羧化酶蛋白为非分泌性蛋白；利用蛋白质的二级结构在线软件预测油莎草PEPC羧化酶蛋白质，结果表明无规则卷曲(L)：β-折叠(E)：α-螺旋(H)为31.92：3.94：64.15，α-螺旋占较大的比例，而β-折叠所占比例较少，三级结构预测结果表明，油莎草PEPCase蛋白为同源四聚体，对其保守结构域预测结果显示油莎草PEPCase蛋白中含有PEPCase超家族保守结构域。

4.油莎草pepc基因的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，具体采用以下技术步骤构建：

(1)设计Oligo DNA序列：根据pP1C.5载体的图谱，在20bp碱基序列上游加入GCAA酶切位点，下游加入CAAA酶切位点，上下游均为BbsI的酶切位点；

(2)引物退火形成双链：将已合成好的互补单链分别加入ddH₂O稀释后配成母液(100μM)；然后分别取20μL的互补单链进行混合，首先95℃加热3min，紧接着将温度降到40℃以下，互补单链配对结合成双链DNA；

(3)CRISPER/Cas9载体的构建：首先加入BbsI对pP1C.5载体进行酶切，回收3.2kb的片段；然后将步骤(2)获得的双链DNA与回收纯化后的3.2kb的片段进行连接、转化DH5a，根据插入位点及pP1C.5的碱基序列设计特异性引物，扩增并送生工测序；后插入Oligo DNA序列的载体即为sgRNA载体；加入EcoRI、NheI对sgRNA载体进行双酶切，切胶回收片段520bp，同时对pP1C.1载体进行EcoRI、XbaI双酶切，回收纯化线性化pP1C.1载体片段；然后将520bp的DNA片段与线性化pP1C.1载体进行连接，转化DH5a，得到油莎草pepc基因CRISPR/Cas9载体。

5.如权利要求4所述的油莎草pepc基因的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述的步骤(3)中设计的特异性引物为：

p5-F：5'-TTATATGGGAAAGAACAATAGTATT-3'；

p5-R：5'-TGCAGAATTCGAAGCTTGAG-3'。