[发明专利]油莎草pepc基因的克隆及表达载体的构建和应用

说明书

技术领域

本发明主要涉及分子生物学技术领域，具体地说，本发明涉及油莎草基因克隆及表达载体的技术领域。

背景技术

油莎草(Cyperus esculentus L.Var.sativus)是块茎含油类作物，莎草科单子叶草本植物。油莎草的含油量是目前油料作物中最高的，被誉为“油料作物之王”，其油酸的含量占脂肪酸含量的72.7％，与被誉为“最健康的油”—橄榄油接近。而培育含油量更高、各种脂肪酸比例更健康的油料作物新品种是作物育种的重要任务之一。根据“底物竞争假说”，植物种子中的脂肪和蛋白质竞争相同的底物-丙酮酸，其中蛋白质的合成是由PEPC羧化酶催化而脂肪的合成由乙酰CoA羧化酶催化，光合作用生成的碳是流向生成脂肪还是生成蛋白质，取决于PEPC羧化酶(PEPCase)与乙酰CoA羧化酶(ACCase)的相对活性。由此可以看出，在油料作物中，PEPC羧化酶活性的强弱直接影响了作物中油脂的含量。

构建pepc基因表达载体，有利于后续pepc基因载体转化油莎草，获得含油率较高的转基因油莎草植株，为培育含油率较高的转基因油莎草植株奠定了基础，对于新品种培育、生产推广具有重要作用。

发明内容

为了培育含油量更高、各种脂肪酸比例更健康的油莎草新品种，本发明旨在于提供一种油莎草pepc基因的克隆及表达载体构建方法，为后续pepc基因载体转化产油植物，获得含油率较高的转基因植株奠定基础。

本发明通过以下技术方案实现的:

本发明具体提供油莎草pepc基因的克隆方法，具体采用以下技术步骤：

(1)以地上茎叶生长至7～8个时的油莎草地上茎叶为材料，提取总RNA；

(2)设计特异引物：

GSP1(5’RACE)：5'-GCTTGTTGAGTATGATGCCCT-3'；

GSP2(3’RACE)：5'-CCCTTCATGGTGAGGATAAGA-3'；

(3)利用正向引物、反向引物进行RACE PCR扩增；

第一步：

扩增体系如下：样本基因组DNA2μl、10*UPM 1.5μl、5’或3’GSP(10μM)1.5μl、La-Taq0.2μl、dNTP 2μl、Mg²⁺2μl、Buffer 2μl、ddH₂O 13.8μl，总计25μl；

扩增程序如下：

94℃预变性5min，94℃30s，56℃30s，72℃3min30s，经34个循环后，72℃延伸10min。

第二步：扩增体系如下：第一步反应物2μl、10*UPM 1.5μl、5’或3’GSP(10μM)1.5μl、La-Taq 0.2μl、dNTP 2μl、Mg²⁺2μl、Buffer2μl、ddH₂O 13.8μl、总计25μl。

优选的，第二步中RACE PCR体系5’和3’RACE温度分别设置为54℃和58℃。

获得PEPCase酶pepc基因全长cDNA，大小为3399bp。

进一步，本发明提供油莎草PEPCase蛋白，PEPCase蛋白氨基酸的数量为965个，理论分子量及等电点分别为110129.27Da和6.07，脂肪系数为90.77，分子式C₄₉₂₀H₇₇₉₇N₁₃₅₃O₁₄₄₆S₃₄；碱性氨基酸(Arg+Lys)为127，酸性氨基酸(Asp+Glu)为140；PEPCase蛋白的GRAVY值为-0.386，该蛋白为亲水性蛋白。PEPC羧化酶蛋白质不包含信号肽，推测油莎草PEPC羧化酶蛋白为非分泌性蛋白；利用蛋白质的二级结构在线软件预测油莎草PEPC羧化酶蛋白质，结果表明无规则卷曲(L)：β-折叠(E)：α-螺旋(H)为31.92：3.94：64.15，α-螺旋占较大的比例，而β-折叠所占比例较少，三级结构预测结果表明，油莎草PEPCase蛋白为同源四聚体，对其保守结构域预测结果显示油莎草PEPCase蛋白中含有PEPCase超家族保守结构域。

本发明还提供一种油莎草pepc基因的CRISPR/Cas9载体，具体采用以下技术步骤构建获得：

(1)设计Oligo DNA序列：根据pP1C.5载体的图谱，在20bp碱基序列上游加入GCAA酶切位点，下游加入CAAA酶切位点，上下游均为BbsI的酶切位点；