[发明专利]携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建

摘要

本发明涉及携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶稳定细胞系的构建方法，该方法借助双慢病毒稳定转导、质粒稳定转染将正交的tRNA/氨酰tRNA合成酶基因稳定整合到细胞基因组。本发明进一步涉及所述方法所获得的稳定细胞系以及该稳定细胞系的应用，如表达含有非天然氨基酸目的蛋白的用途，从而可利用非天然氨基酸上特有的活性基团，可以实现高效，特异性的修饰蛋白的目的。

主权项

1.一种稳定细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在携带第一抗性基因的pSD31‑IRES上连接吡咯赖氨酰‑tRNA合成酶基因，获得携带第一抗性基因的病毒载体1号pSD31‑pylRS‑IRES；(2)在携带第二抗性基因的pSD31‑IRES上连接带有突变的绿色荧光蛋白基因，获得携带第二抗性基因的病毒载体2号pSD31‑GFP39TAG‑IRES；(3)构建携带第三抗性基因的具有12个拷贝数type‑3Pol III启动子启动的正交tRNA的载体pXH‑12tRNA；(4)将(1)和(2)中所述的病毒载体1号pSD31‑pylRS‑IRES和病毒载体2号pSD31‑GFP39TAG‑IRES，转导至宿主细胞，分别用第一抗性基因和第二抗性基因进行两轮筛选，获得整合了吡咯赖氨酰‑tRNA合成酶基因和突变型绿色荧光蛋白报告基因的稳定细胞系；(5)将步骤(3)中所述的载体pXH‑12tRNA转染到步骤(4)中所获得的稳定细胞系，并利用其上携带的第三抗性基因进行第三轮筛选；(6)在培养基中加入非天然氨基酸，流式分选筛选带有绿色荧光的单克隆，并扩大培养，最终得到稳定细胞系。