[发明专利]携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建

权利要求书

1.一种稳定细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在携带第一抗性基因的pSD31-IRES上连接吡咯赖氨酰-tRNA合成酶基因，获得携带第一抗性基因的病毒载体1号pSD31-pylRS-IRES；

(2)在携带第二抗性基因的pSD31-IRES上连接带有突变的绿色荧光蛋白基因，获得携带第二抗性基因的病毒载体2号pSD31-GFP^39TAG-IRES；

(3)构建携带第三抗性基因的具有12个拷贝数type-3Pol III启动子启动的正交tRNA的载体pXH-12tRNA；

(4)将(1)和(2)中所述的病毒载体1号pSD31-pylRS-IRES和病毒载体2号pSD31-GFP^39TAG-IRES，转导至宿主细胞，分别用第一抗性基因和第二抗性基因进行两轮筛选，获得整合了吡咯赖氨酰-tRNA合成酶基因和突变型绿色荧光蛋白报告基因的稳定细胞系；

(5)将步骤(3)中所述的载体pXH-12tRNA转染到步骤(4)中所获得的稳定细胞系，并利用其上携带的第三抗性基因进行第三轮筛选；

(6)在培养基中加入非天然氨基酸，流式分选筛选带有绿色荧光的单克隆，并扩大培养，最终得到稳定细胞系。

2.根据权利要求1所述的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述宿主细胞为CHO-K1细胞。

3.根据权利要求1所述的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，第一抗性基因是嘌呤霉素抗性基因，第二抗性基因是潮霉素B抗性基因，和/或第三抗性基因是杀稻瘟菌素抗性基因；

步骤(1)中所述携带第一抗性基因的pSD31-IRES是如SEQ ID NO:2所示的pSD31-IRES-puro，所述携带第一抗性基因的病毒载体1号pSD31-pylRS-IRES是如SEQ ID NO:4所示的病毒载体pSD31-pylRS-IRES-puro；

步骤(2)中所述携带第二抗性基因的pSD31-IRES是如SEQ ID NO:3所示的pSD31-IRES-hygro；所述携带第二抗性基因的病毒载体2号pSD31-GFP^39TAG-IRES是如SEQ ID NO:5所示的的病毒载体pSD31-GFP^39TAG-IRES-hygro；和/或

步骤(3)中所述载体为如SEQ ID NO:6所示的载体pXH-12tRNA-blasticidin。

4.根据权利要求3所述的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(4)为：首先转导病毒载体2号，利用其携带的潮霉素B抗性基因进行筛选，获得整合突变型绿色荧光蛋白报告基因的稳定细胞系；再转导病毒载体1号，利用其携带的嘌呤霉素抗性基因进行筛选，获得了同时整合了突变型绿色荧光蛋白报告基因和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶基因的稳定细胞系。

5.根据权利要求4所述的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，潮霉素B的筛选浓度为300ug/ml，杀稻瘟菌素的筛选浓度为15ug/ml，和/或嘌呤霉素的筛选浓度为12ug/ml。

6.根据权利要求3所述的稳定细胞系的构建方法，其特征在于，所述非天然氨基酸为含有叠氮基团的非天然氨基酸Lys-azido(NAEK)

或者含有光交联基团的非天然氨基酸Lys-diazirine(DiZPK)

7.根据权利要求1-6任一方法获得的稳定细胞系，其是CHO-K1-WY，保藏号为CGMCC No：14285。

8.一种如权利要求7所述的稳定细胞系在制备含有非天然氨基酸的蛋白或肽中的应用。

9.利用权利要求7所述的稳定细胞系所获得的至少一个位点上的氨基酸被突变为非天然氨基酸的蛋白或肽。

10.药物组合物，其中含有有效量的权利要求9中的蛋白或肽，特别是用于抗病毒，治疗多种恶性肿瘤、免疫调节。