[发明专利]携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建

说明书

本发明涉及携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶稳定细胞系的构建方法，该方法借助双慢病毒稳定转导、质粒稳定转染将正交的tRNA/氨酰tRNA合成酶基因稳定整合到细胞基因组。本发明进一步涉及所述方法所获得的稳定细胞系以及该稳定细胞系的应用，如表达含有非天然氨基酸目的蛋白的用途，从而可利用非天然氨基酸上特有的活性基团，可以实现高效，特异性的修饰蛋白的目的。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶稳定细胞系的构建方 法。

背景技术

1)基因密码子扩展技术

近年来遗传密码扩展技术发展迅速，利用琥珀终止密码子为有义编码子，通过引入相 应的正交tRNA及氨酰tRNA合成酶，最终可以将设计好的非天然氨基酸引入蛋白质中。根 据非天然氨基酸的性质,可以赋予蛋白质特殊的功能。到目前为止，这一技术已经将上百种 非天然氨基酸成功地定点表达在蛋白质表面,涉及的非天然氨基酸包括含有叠氮、炔基、酮 基、醛基、烯基、酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸根等多样性功能基团，可进行多种生物正交反应，如：点击化学、光敏感、糖基化、光交联等反应。

2)基因密码子扩展技术在蛋白质药物开发中的应用

现代生物技术的发展，使得蛋白质药物的大规模生产成为现实，这类药物应用于临床 的数量也越来越多。蛋白质药物是指多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、 重组疫苗。与以往的小分子药物相比,蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功 能明确、有利于临床应用的特点。但是，蛋白类药物也有其稳定性差、膜通透性差、生物半衰期短等缺点，影响了蛋白质药物的治疗潜力和临床应用。对天然蛋白结构进行改造或修饰是获取更好药代动力学性质的一种有效途径。各种修饰多从改变重组蛋白的性状入手，如增加相对分子质量、减缓蛋白酶降解、降低免疫原性、提高生物及化学稳定性等， 进而改善其体内药代动力学性质、延长体内半衰期或加速体内释放、降低中和抗体产生 率、提高患者适应性及治疗效果等。鉴于改构或修饰后蛋白质的众多优势，对蛋白质进行 重组改构以及体内外修饰也必将得到越来越为广泛的应用。第一代蛋白质修饰技术的缺陷 在于对偶联位点的不可控性，所以传统的修饰方法是非定点非定量的，并不适合大规模生 产制备的质量控制。而非天然氨基酸修饰技术位点可控的优点，在蛋白质修饰领域有广泛 应用前景。以抗体偶联药物为例，同传统修饰位点不可控的ADC(抗体药物偶联物)药物 相比，位点特异性ADC药物的特异性强、成份单一、毒性低，无疑是未来靶向药物的发展 方向(Tian Feng.et al.PNAS,2014,111:1766–1771.)。

3)基因密码子扩展技术工业应用的瓶颈

按照宿主细胞的类型，可将蛋白质表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳 动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质 的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。在工业上，要想实现蛋白质药物的高产量大规模化生产，就需要构建目的基因的高表达稳定细胞系。而将非天然氨基酸应用于蛋白质药物的开发上，一个亟待解决的问题就是如何构建稳定整合正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的工程细胞。由于tRNA的转录和加工有异于蛋白质，因此如何实现正交tRNA的高效稳定表达依旧是个国际难题。实现稳定整合正交tRNA/氨酰tRNA合成酶工程细胞的构建，将有效促进基因密码子扩展技术在蛋白质药物开发中的应用。

发明内容