[发明专利]蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明属于蜂房蜜蜂球菌检测技术领域，公开了一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，根据M.pluton 16S rRNA基因序列设计了特异性引物和探针，建立蜜蜂欧洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，从标准品浓度1.0×108拷贝/μL～1.0×102拷贝/μL呈良好的线性关系，扩增效率可达0.999；与P.larvae、N.apis、A.apis等蜜蜂常见疫病病原无交叉反应；敏感性试验结果显示，可检出最低1.0×10拷贝/μL的目的基因，与普通PCR相比，灵敏度提高了1000倍；批内、批间实验表明有着较好的重复性；样品检测结果表明该方法具有广泛的适用性。

主权项

一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：步骤一，将M.pluton基因组DNA进行普通PCR扩增，获得大小为157bp的目的片段，PCR产物经回收、克隆、转化、普通PCR和测序鉴定后作同源性比对，与GenBank中登录序列同源性达到100％；将构建的pXT‑16S重组质粒标准品用微量紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm＝1.92，计算其浓度为1.0×108拷贝/μL；步骤二，应用矩阵法对荧光定量PCR的引物、探针浓度和退火温度进行优化后的反应参数为：10×PCRbuffer 2.5μL，MgCl21.5μL，dNTPs2μL，上下游引物各1μL，特异性探针0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，模板DNA 1μL，加灭菌ddH2O至25μL；优化后的反应条件为：92℃3min；92℃10s、60℃30s，40个循环，60℃时收集荧光信号。