[发明专利]蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：

步骤一，将M.pluton基因组DNA进行普通PCR扩增，获得大小为157bp的目的片段，PCR产物经回收、克隆、转化、普通PCR和测序鉴定后作同源性比对，与GenBank中登录序列同源性达到100％；将构建的pXT-16S重组质粒标准品用微量紫外分光光度计测定OD_260nm/OD_280nm＝1.92，计算其浓度为1.0×10⁸拷贝/μL；

步骤二，应用矩阵法对荧光定量PCR的引物、探针浓度和退火温度进行优化后的反应参数为：10×PCRbuffer 2.5μL，MgCl₂1.5μL，dNTPs2μL，上下游引物各1μL，特异性探针0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，模板DNA 1μL，加灭菌ddH₂O至25μL；优化后的反应条件为：92℃3min；92℃10s、60℃30s，40个循环，60℃时收集荧光信号。

2.如权利要求1所述的蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述F/R上下游引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

3.如权利要求1所述的蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述探针的序列为SEQ ID NO：3。

4.如权利要求1所述的蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法具体包括以下步骤：

DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；

对照设置：蜂房蜜蜂球菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；

PCR反应体系配置：在PCR管中加入10×PCRbuffer 2.5μL，MgCl₂1.5μL，dNTPs 2.0μL，上下游引物各1.0μL，特异性探针0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，模板DNA 1.0μL，加灭菌ddH₂O 15.0μL，使反应总体积为25.0μL；

PCR反应程序：92℃预变性3min；92℃变性10s、60℃退火延伸30s，共40个循环，在60℃时收集荧光信号；

结果判定：阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤36，并且出现典型的扩增曲线，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品无Ct值，并且无扩增曲线，表示样品中无蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值≤36，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值>36的样品重复检测，重复检测结果无Ct值表示样品中无蜂房蜜蜂球菌，重复检测结果有Ct值表示样品中存在蜂房蜜蜂球菌。