[发明专利]蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于蜂房蜜蜂球菌检测技术领域，尤其涉及一种蜂房蜜蜂球菌 TaqMan荧光定量PCR检测方法。

背景技术

欧洲幼虫腐臭病(European foulbrood，EFB)是由蜂房蜜蜂球菌 (Melissococcus pluton，M.pluton)引起的蜜蜂幼虫死亡的一种细菌性传染病，在蜂群迅速生长时多发，最常见的症状是蜜蜂幼虫在巢房封盖前不久死亡。M.pluton对外界不良环境的抵抗力强，能在蜂尸上存活数年，在蜂蜜里也能保持长久的毒性，在蜂群间能通过患病蜂带入传播，可引起蜂群的毁灭。但引起蜜蜂幼虫死亡也有其它疾病和原因，仅依靠临床症状诊断EFB并不可靠。目前，在实验室诊断技术方面，已有细菌涂片镜检法、扫描电子显微镜法、分离培养法、蜂巢污迹染色法、凝集试验法、酶联免疫吸附试验法和DNA杂交试验法等，上述诊断方法全部是基于病原分离培养鉴定基础之上的，由于蜂房蜜蜂球菌对培养条件要求极其苛刻，且存在与其它许多次生菌的竞争，分离培养困难，上述诊断方法很难对欧洲幼虫腐臭病做出准确诊断和推广应用。由于PCR技术在病原体检测方面的独特优势，国外许多研究者根据蜂房蜜蜂球菌16Sr RNA基因设计不同引物或探针，建立了多种PCR方法。我国虽在蜜蜂疫病防控方面开展了大量工作，但与其它家畜疫病防控相比，还存在技术落后的现状，所以国内还未见有EFB病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的报道。

综上所述，现有技术存在的问题是：

1、现有的EFB实验室诊断方法全部是基于病原分离培养鉴定基础之上的，但蜂房蜜蜂球菌对培养条件要求极其苛刻，分离培养困难，对该病很难做出准确诊断，诊断方法也很难推广应用。

2、国外在EFB的实验室诊断方面建立了多种PCR方法，但我国缺少具有自主知识产权的快速、准确、高通量、易于推广的PCR方法，不利于我国蜜蜂疫病的防控。

3、目前，已建立的EFB普通PCR只能对终产物进行分析，无法对起始模版准确定量和对扩增反应实时监测，必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，流程较复杂，且在实验室内使用EB等有毒物质。而荧光定量PCR试验过程全封闭，仪器自动分析和获取试验结果，无后续试验操作，可对起始模版准确定量和扩增反应实时监测，且荧光定量PCR的特异性、灵敏度、自控化程度等均高于普通PCR。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。

本发明是这样实现的，一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，所述蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：

步骤一，将M.pluton基因组DNA进行普通PCR扩增，获得大小为157bp的目的片段，PCR产物经回收、克隆、转化、普通PCR和测序鉴定后作同源性比对，与GenBank中登录序列同源性达到100％；将构建的pXT-16S重组质粒标准品用微量紫外分光光度计测定OD_260nm/OD_280nm＝1.92，计算其浓度为1.0×10⁸拷贝/μL；

步骤二，应用矩阵法对荧光定量PCR的引物、探针浓度和退火温度进行优化后的反应参数为(25μL)：10×PCR buffer 2.5μL，MgCl₂(25mmol)1.5μL， dNTPs(2.5mmol)2μL，上下游引物(10μmol)各1μL，特异性探针(10μmol) 0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA 1μL，加灭菌ddH₂O至 25μL；优化后的反应条件为：92℃3min；92℃10s、60℃30s，40个循环， 60℃时收集荧光信号。

进一步，所述F/R上下游引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

进一步，所述探针的序列为SEQ ID NO：3。

进一步，所述蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法具体包括以下步骤：DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；

对照设置：蜂房蜜蜂球菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；