[发明专利]一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏定量检测方法

摘要

本发明涉及一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏定量检测方法，属于生物医学检测技术领域。本发明所述检测方法是通过核酸适配体对心肌肌钙蛋白I进行特异性识别，并利用核酸的滚环扩增技术和基于氧化石墨烯的荧光共振能量转移技术，实现对cTnI的准确灵敏的定量检测；所述检测方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便以及成本低等优点，符合临床检测的需求。

主权项

1.一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏度定量检测方法，其特征在于：所述方法步骤如下：(1)将包被缓冲液稀释后的cTnI抗体包被至黑色酶标板上，然后在37℃下孵育2h；(2)弃去黑色酶标板上的液体，再加入封闭液，并在4℃下封闭1h以上；(3)弃去黑色酶标板上的液体，用PBST洗涤黑色酶标板3～5次，且完成最后一次洗涤后，倒去液体并拍干；(4)将黑色酶标板上的孔划分成不同的实验组，分别将不同浓度的cTnI以及含cTnI的待测样品加入到不同的实验组中，然后在37℃下孵育1h；(5)重复步骤(3)的操作；(6)向黑色酶标板中加入用筛选缓冲液稀释的适配体环化产物，然后在37℃下孵育1h；(7)重复步骤(3)的操作；(8)向黑色酶标板中加入RCA体系，并在37℃下反应12h～15h；(9)弃去黑色酶标板中的液体，先用PBST洗涤2～5次，再用PBS洗涤2～5次，且完成最后一次洗涤后，倒空液体并拍干；(10)向黑色酶标板中加入检测体系后检测荧光强度，根据检测结果绘制标准曲线；根据标准曲线计算待测样品中cTnI浓度；其中，激发波长为492nm，检测波长为520nm；步骤(1)中，所述包被缓冲液的组成成分及各成分的浓度如下：Na₂CO₃ 15mM以及NaHCO₃ 35mM，其中溶剂为水；步骤(2)中，所述封闭液由BSA和PBST组成；其中，1mL PBST中含有1mg BSA，所述PBST是含有体积分数为0.05％Twen‑20的磷酸盐缓冲溶液；所述筛选缓冲液的组成组分及各成分的浓度如下：NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄·12H₂O 6.5mM，NaH₂PO₄·2H₂O 1.8mM以及MgCl₂ 1.47mM，其中溶剂为水；所述适配体环化产物的组成成分及各成分的浓度如下：适配体引物复合物0.1μM，锁式探针0.1μM，T4 DNA连接酶10U，T4 DNA连接酶Buffer，其中溶剂为水；所述适配体引物复合物的核苷酸序列选自序列表中的SEQ ID NO.1，锁式探针的核苷酸序列选自序列表中的SEQ ID NO.2；步骤(8)中，RCA体系的组成成分及各成分的浓度如下：phi 29 DNA聚合酶10U、phi29 DNA聚合酶缓冲液以及dNTP 0.5mM，其中溶剂为水；步骤(10)中，检测体系的组成成分及各成分的浓度如下：氧化石墨烯25μg/mL以及FAM标记的ssDNA探针60nM，其中溶剂为水；所述FAM标记的ssDNA探针中的ssDNA核苷酸序列选自序列表中的SEQ ID NO.3。