[发明专利]一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏定量检测方法

权利要求书

1.一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏度定量检测方法，其特征在于：所述方法步骤如下：

(1)将包被缓冲液稀释后的cTnI抗体包被至黑色酶标板上，然后在37℃下孵育2h；

(2)弃去黑色酶标板上的液体，再加入封闭液，并在4℃下封闭1h以上；

(3)弃去黑色酶标板上的液体，用PBST洗涤黑色酶标板3～5次，且完成最后一次洗涤后，倒去液体并拍干；

(4)将黑色酶标板上的孔划分成不同的实验组，分别将不同浓度的cTnI以及含cTnI的待测样品加入到不同的实验组中，然后在37℃下孵育1h；

(5)重复步骤(3)的操作；

(6)向黑色酶标板中加入用筛选缓冲液稀释的适配体环化产物，然后在37℃下孵育1h；

(7)重复步骤(3)的操作；

(8)向黑色酶标板中加入RCA体系，并在37℃下反应12h～15h；

(9)弃去黑色酶标板中的液体，先用PBST洗涤2～5次，再用PBS洗涤2～5次，且完成最后一次洗涤后，倒空液体并拍干；

(10)向黑色酶标板中加入检测体系后检测荧光强度，根据检测结果绘制标准曲线；根据标准曲线计算待测样品中cTnI浓度；其中，激发波长为492nm，检测波长为520nm；

步骤(1)中，所述包被缓冲液的组成成分及各成分的浓度如下：Na₂CO₃ 15mM以及NaHCO₃35mM，其中溶剂为水；

步骤(2)中，所述封闭液由BSA和PBST组成；其中，1mL PBST中含有1mg BSA，所述PBST是含有体积分数为0.05％Twen-20的磷酸盐缓冲溶液；

所述筛选缓冲液的组成组分及各成分的浓度如下：NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄·12H₂O 6.5mM，NaH₂PO₄·2H₂O 1.8mM以及MgCl₂ 1.47mM，其中溶剂为水；

所述适配体环化产物的组成成分及各成分的浓度如下：适配体引物复合物0.1μM，锁式探针0.1μM，T4 DNA连接酶10U，T4 DNA连接酶Buffer，其中溶剂为水；所述适配体引物复合物的核苷酸序列选自序列表中的SEQ ID NO.1，锁式探针的核苷酸序列选自序列表中的SEQID NO.2；

步骤(8)中，RCA体系的组成成分及各成分的浓度如下：phi 29 DNA聚合酶10U、phi29DNA聚合酶缓冲液以及dNTP 0.5mM，其中溶剂为水；

步骤(10)中，检测体系的组成成分及各成分的浓度如下：氧化石墨烯25μg/mL以及FAM标记的ssDNA探针60nM，其中溶剂为水；所述FAM标记的ssDNA探针中的ssDNA核苷酸序列选自序列表中的SEQ ID NO.3。

2.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏度定量检测方法，其特征在于：cTnI抗体的体积与包被缓冲液的体积比为1:1000。

3.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏度定量检测方法，其特征在于：步骤(4)中，在0～500pg/mL范围内选择6组以上不同浓度的cTnI。

4.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏度定量检测方法，其特征在于：步骤(6)中，适配体环化产物在筛选缓冲液中的浓度为50nM。

5.根据权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏度定量检测方法，其特征在于：所述适配体环化产物的制备步骤如下：将适配体引物复合物、锁式探针、T4 DNA连接酶、T4DNA连接酶Buffer以及去离子水混合，然后置于37℃下反应2h，再沸水浴5min～10min，得到适配体环化产物。